Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Las fuentes de financiación de la investigación: un fondo conjunto de la empresa de la Universidad de Tel Aviv, la transferencia de tecnología, RAMOT y el Centro Médico Sheba-(M. CA y SI.), ICRF - Fundación para la Investigación del Cáncer de Israel (M. CA.) Y la Fundación Israel ciencia ( SI).

1. Cultivo de células Preparación Células MDA-MB-231 se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection) y se almacenan en nitrógeno líquido. <ol><li> Seed 10 6 MDA-MB-231 células en 92 mm de diámetro en una placa de Petri 10 ml de medio completo que contenía medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM), 10% de suero de caballo, 1% de L-glutamina, y 1% Penstrep-anfotericina B. Permiten a las células a proliferar a aproximadamente 80-100% de confluencia. </li><l...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

Vivo imagen confocal proporciona una documentación en tiempo real del efecto citotóxico de PJ-34 en las células de múltiples centrosomales en vivo durante la mitosis (Figura 3 y la información complementaria). Esta fue la primera documentación vivo atribuir la citotoxicidad de PJ-34 en células de cáncer humano a centrosomas adicionales de-agrupación y la muerte celular, lo que sugiere la inducción de la muerte celular mitótica catástrofe por PJ-34 5-9. En contraste, se observó la...

Fenantreno deriva inhibidores PARP1, incluyendo PJ-34, fueron diseñados para proteger a las células en reposo de la muerte celular apoptótica inducida por la energía que consume PARP1 mediada por reparación del ADN en condiciones de estrés (accidente cerebrovascular o infarto de miocardio) 1. Sin embargo, recientemente hemos descubierto que PJ-34, a dos veces mayor que la concentración que induce la inhibición PARP1, puede causar exclusivamente la muerte celular en células humanas de cáncer 2,3. Cuanto más rápida sea la proliferación de la célula era, más eficiente será la erradicación de las células era. La actividad citotóxica de PJ-34 se atribuyó a extra-centrosomas de-agrupación en la mitosis 2. Muchas células cancerosas puerto humana multicentrosomes 4,5. La incubación de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231, que albergan centrosomas supernumerarios, con 20 mM PJ-34 de manera eficiente erradicado estas células dentro de 72-96 horas sin perjudicar las células quiescentes o algunas células proliferantes benignas albergar dos centrosomas en la mitosis <sup&gt; 2,3. Células benignas incluyen las células epiteliales mamarias humanas MCF-10, células endoteliales humanas (HUVEC) y las células mesenquimales primarios preparados a partir de timo humano. Estas células fueron resistentes a la actividad citotóxica de PJ-34. PJ-34 no interfirió con su ciclo celular durante 96 horas de incubación o afectan a sus centrosomas y la formación del huso bi-focal 2,3. Montaje centrosoma bipolar es crucial para la formación del huso bipolar en la mitosis 4,5. Por lo tanto, las células con más de dos centrosomas han desarrollado un mecanismo molecular escasamente entendido, la agrupación de sus centrosomas adicionales en dos polos 4-9. El fallo de montaje bipolar de sus centrosomas puede causar multipolar distorsionada husillos y la segregación aberrante de cromosomas que las detenciones del ciclo celular en G2 / M detención, y conduce a la muerte celular atribuidos al fracaso mitótico 4,5. Los mecanismos moleculares que subyacen a centrosomas adicional-de-agrupación se investigaron intensamente &lt;sup&gt; 10. La comprensión de este mecanismo de la muerte permitirá la erradicación de la exclusiva de las células cancerosas sin dañar los tejidos sanos 5,10. Por lo tanto, los compuestos que activan la muerte celular mitótica catástrofe ofrecen un nuevo modo de una terapia contra el cáncer selectiva, que puede ser eficaz en una amplia gama de resultados cancers.Our sólidos humanos sugieren que la imagen confocal se puede utilizar para identificar moléculas que afectan extra-centrosomas en la agrupación la mitosis 2,3, lo que hace estos compuestos cáncer de focalización candidatos de la droga. Hemos documentado la actividad citotóxica de la fenantridina PJ-34 mediante el escaneo de las células cancerosas humanas fijadas y en vivo (con alta ocurrencia de adicional-centrosomas en la mitosis) frente a las células normales. Un paso a paso la descripción de los procedimientos de imagen utilizados para identificar la actividad citotóxica de PJ-34 en células de cáncer humano se incluye a continuación.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

Derivados de fenantreno que actúan como potentes inhibidores PARP1 impidió la agrupación bi-focal de centrosomas supernumerarios en células humanas de cáncer de varios centrosomales en mitosis. El fenantridina PJ-34 era la molécula más potente. Desagrupación de actividades extra-centrosomas causa insuficiencia mitótico y la muerte celular en células multi-centrosomales. Cánceres humanos más sólidos tienen alta incidencia de extra-centrosomas. La actividad de PJ-34 se documentó en tiempo real, mediante formación de imágenes confocal de cáncer de mama humano en vivo las células MDA-MB-231 transfectadas con vectores que codifican para fluorescente γ-tubulina, que es muy abundante en los centrosomas y para fluorescente presente en la histona H2B los cromosomas. Arreglos de cromosomas aberrantes y de focos agrupados-γ-tubulina que representan centrosomas declustered se detectaron en las células transfectadas MDA-MB-231 después del tratamiento con PJ-34. Un-agrupados adicional-centrosomas en los dos polos del huso precedieron la muerte celular. Estos resultados vinculados FOr la primera vez que la actividad citotóxica exclusiva recientemente detectado de PJ-34 en células de cáncer humano con centrosomas adicional-de-la agrupación en la mitosis, y el fracaso mitótico que conduce a la muerte celular. De acuerdo con los resultados anteriores observados por microscopía confocal de células fijas, PJ-34 células de cáncer erradicado exclusivamente con múltiples centrosomas sin afectar las células normales en mitosis con dos centrosomas y cabezales bi-focal. Esta actividad citotóxica de PJ-34 no fue compartida por otros inhibidores potentes PARP1, y se observó en PARP1 deficientes extracentrosomes albergan MEF, lo que sugiere su independencia de la inhibición de PARP1. Vivir imagen confocal ofrecen una herramienta útil para la identificación de nuevas moléculas erradicar las células durante la mitosis.

PJ-34 es un soluble en agua estable fenantridina 1 (Figura 1). Nuestros resultados anteriores revelaron la muerte celular y extra-centrosomas de-agrupados en varios tipos de células de cáncer de múltiples centrosomales fijos que fueron tratados con PJ-34. En contraste, las células normales en proliferación no fueron perjudicados 2,3. Centrosomas se identificaron mediante doble marcaje con anticuerpos dirigidos contra centrine1 y γ-tubulina en las células extra-centrosomales ...

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Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

La actividad citotóxica de la fenantridina PJ-34 en células de cáncer sometidos a la mitosis se documentó en tiempo real por imagen confocal en vivo. 34 PJ-erradicar el cáncer de mama humano MDA-MB-231 células que albergan actividades extra-centrosomas en la mitosis. A diferencia de la mitosis bi-focal normal, las actividades extra-centrosomas no se agruparon en los dos polos del huso en la presencia de PJ-34.

La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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