Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Finansieringskällor denna forskning: en gemensam fond av Tel Aviv University tekniköverföring företaget, RAMOT och Sheba-Medical Center (M. CA och SI.), ICRF - israelisk Cancer Research Foundation (M. CA.) Och Israel Science Foundation ( SI).

Ett. Cell Culture Framställning MDA-MB-231-celler köptes från ATCC (American Type Culture Collection) och lagrades i flytande kväve. <ol><li> Seed 10 6 MDA-MB-231-celler i 92 mm diameter petriskål i 10 ml komplett medium innehållande Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% hästserum, 1% L-glutamin och 1% Penstrep-Amfotericin B. Låt celler att proliferera till ca 80 till 100% konfluens. </li><li> Ta bort odlingsmedium från skålen och släng. </li><li> Tvätta...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

Live konfokal avbildning tillgänglig i realtid dokumentation av den cytotoxiska effekten av PJ-34 med levande multi-centrosomal celler under mitos (Figur 3 och Kompletterande information). Detta var den första levande dokumentation tillskriva cytotoxicitet av PJ-34 i humana cancerceller till extra centrosomes de-klustring och celldöd, vilket tyder på induktion av Mitotisk Catastrophe celldöd av PJ-34 5-9. Däremot var bi-focal klustring av super-numerary centrosomes observerats i levande...

Fenantren härstammar PARP1 hämmare, inklusive PJ-34, var avsedda att skydda vilande celler från apoptotiska celldöd inducerad av energikrävande PARP1 medierad DNA-reparation enligt stressbetingelser (stroke eller hjärtinfarkt) 1. Men nyligen upptäckte vi att PJ-34, två gånger högre koncentration än den inducerande PARP1 inhibition, uteslutande kan orsaka celldöd i humana cancerceller 2,3. Den snabbare proliferationen av cellen var, var den effektivare utrotning av cellerna. Den cytotoxiska aktiviteten av PJ-34 tillskrevs extra-centrosomes de-klustring i mitos 2. Många humana cancerceller hamnen multicentrosomes 4,5. Inkubation av humana bröstcancerceller MDA-MB-231 som hyser övertaliga centrosomes, med 20 ^ M PJ-34 effektivt utrotas dessa celler inom 72-96 h utan att försämra vilande celler eller några godartade prolifererande celler härbärgerande två centrosomes i mitos <sup&gt; 2,3. Godartade celler inkluderade mänskliga bröst epitelceller MCF-10, humana endotelceller (HUVEC) och primära mesenkymala celler framställda från human tymus. Dessa celler var resistenta mot den cytotoxiska aktiviteten hos PJ-34. PJ-34 inte störa deras cellcykeln under 96 h inkubation eller påverka deras centrosomes och bi-focal spindel formation 2,3. Bipolär centrosomen montering är avgörande för bipolär spindel formation i mitos 4,5. Därför har celler med mer än två centrosomes utvecklat en knappast förstådd molekylär mekanism är kluster sina extra centrosomes vid två poler 4-9. Underlåtenhet av bipolär montering av sina centrosomes kan orsaka multipolär förvrängd spindlar och avvikande kromosomer segregation som hejdar cellen-cykeln i G2 / M gripandet, och leder till celldöd tillskrivs mitotic misslyckande 4,5. De molekylära mekanismerna bakom extra-centrosomes de-klustring är intensivt undersökt &lt;sup&gt; 10. Att förstå denna död mekanism kommer att exklusivt utrota cancerceller utan att skada friska vävnader 5,10. Således, föreningar som aktiverar mitotic död katastrof cell erbjuder en ny form av ett selektivt cancerterapi, som kan vara effektiva i ett brett spektrum av humana fasta cancers.Our resultat tyder på att konfokal avbildning kan användas för att identifiera molekyler som påverkar extra centrosomes klustring i mitos 2,3, vilket gör dessa föreningar cancer inriktning läkemedelskandidater. Vi har dokumenterat den cytotoxiska aktiviteten hos fenantridin PJ-34 genom att skanna fasta och levande humana cancerceller (med hög förekomst av extra-centrosomes i mitos) kontra normala celler. En steg-för-steg beskrivning av imaging metoder som används för att identifiera den cytotoxiska aktiviteten av PJ-34 i humana cancerceller ingår nedan.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

Fenantrenderivaten agerar som potenta PARP1 hämmare förhindrade bifokala klustring av övertaliga centrosomes i flera centrosomal humana cancerceller i mitos. Den fenantridin PJ-34 var den mest potenta molekylen. Declustering av extra-centrosomes orsakar mitotic misslyckande och celldöd i flera centrosomal celler. De flesta fasta humana cancrar har hög förekomst av extra-centrosomes. Aktiviteten av PJ-34 dokumenterades i realtid genom konfokal avbildning av levande humana bröstcancer MDA-MB-231-celler transfekterade med vektorer som kodar för fluorescerande γ-tubulin, som är rikligt i de centrosomes och för fluorescerande histon H2b närvarande i kromosomerna. Avvikande kromosomer arrangemang och de-klustrade γ-tubulin brännpunkter representerar declustered centrosomes upptäcktes i de transfekterade MDA-MB-231-celler efter behandling med PJ-34. Un-klustrade extra-centrosomes i de två spindel polerna föregick deras celldöd. Dessa resultat kopplade for första gången nyligen upptäckt exklusiva cytotoxiska aktiviteten hos PJ-34 i humana cancerceller med extra-centrosomes de-klustring i mitos, och mitotic misslyckande leder till celldöd. Enligt tidigare fynd som observerats med konfokal avbildning av fasta celler, PJ-34 uteslutande utrotas cancerceller med multi-centrosomes utan att försämra normala celler genomgår mitos med två centrosomes och bi-focal spindlar. Denna cytotoxiska aktivitet av PJ-34 delades inte av andra potenta PARP1 hämmare, och observerades i PARP1 bristfälliga MEF härbärgerar extracentrosomes, vilket tyder på dess självständighet av PARP1 inhibition. Live konfokala imaging erbjuds ett användbart verktyg för att identifiera nya molekyler utrota celler under mitos.

PJ-34 är en stabil vattenlöslig fenantridin 1 (figur 1). Våra tidigare resultat avslöjade celldöd och de-klustrade extra centrosomes i flera typer av fasta multi-centrosomal cancerceller som behandlades med PJ-34. Däremot var normala celler som förökar sig inte nedskrivna 2,3. Centrosomes identifierades genom dubbel märkning med antikroppar riktade mot centrine1 och γ-tubulin i det fasta extra-centrosomal celler 2. Här var den cyto...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Den cytotoxiska aktiviteten hos fenantridin PJ-34 i cancerceller som genomgår mitos dokumenterades i realtid genom levande konfokal avbildning. PJ-34 utrotas human bröstcancer MDA-MB-231 celler, som hyser extra-centrosomes i mitos. Till skillnad från vanlig bifokala mitos, var extra-centrosomes inte klustrade i de två spindeln poler i närvaro av PJ-34.

Cell Death samband med onormal Mitos observerades av Confocal Imaging i Live cancerceller

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Högeffektiva Transduction Celler Levercancer med rekombinant Adeno-associerad serotyp 3 Vektorer

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex vivo Infektion av levande vävnad med oncolytic Virus

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon avbildning av tumörcellen invasion i ett Orthotopic musmodell av oral skivepitelcancer

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Utvärdering av cancer Stem Cell Migration Använda Compartmentalizing mikroflödessystem enheter och levande cell imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller för 4D Live-cell imaging av tumör: mikromiljö Interaktioner som påverkar malign progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Modellering Kolit-associerad cancer med Azoxymethane (AOM) och dextransulfat Natrium (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Realtidsundersökningen av Drug svar i tumören mikromiljön i musmodeller av bröstcancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

En Multiplex Luciferas screening plattform för Förhöra cancer-associerade Signaltransduktion i odlade celler

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Bedöma fagocyterande Avslut av celldöd i experimentell stroke genom ligerbara fluorescerande prober

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av östrogenreglerade MicroRNAs i bröstcancerceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...