Name: isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments
Uploaded: 2013-07-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af afdelingen for Intramural Research for National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA. Alle mus blev fastholdt på et American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care-akkrediteret dyrefacilitet på National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIAID), og har til huse i overensstemmelse med de procedurer, der er skitseret i Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i regi af en protokol godkendt af Animal Care og brug Udvalg NIAID.

1.. Isolering af knoglemarvsceller hos mus <ol><li> Aflive mus ved anvendelse af institutionens dyrepleje udvalg-godkendte protokol og spray dyret overflade med 70% ethanol. </li><li> Lave et snit i huden i midten maven og fjerne skindet fra den distale del af musen, herunder huden, der dækker de nedre ekstremiteter. </li><li> Skær musklerne fra underekstremiteterne med en saks og omhyggeligt forskubbe acetabulum fra hofteleddet, og samtidig undgå at bryde lårbenshovedet. </li><li> Fjerne de resterende muskler fra...

<ol>
	<li>Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+host+defense.">Neutrophils and host defense.</a> Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).</li><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).</li><li>Blomgran, R., Ernst, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+neutrophils+facilitate+activation+of+naive+antigen-specific+CD4++T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).</li><li>Narasaraju, T., Yang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+neutrophils+and+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+acute+lung+injury+of+influenza+pneumonitis.">Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis.</a> Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).</li><li>Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+Ccr1+drives+neutrophil-mediated+kidney+immunopathology+and+mortality+in+invasive+candidiasis.">Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis.</a> PLoS Pathog. 8 (8), (2012).</li><li>Casc&#227;o, R., Ros&#225;rio, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+rheumatoid+arthritis:+More+than+simple+final+effectors.">Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors.</a> Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).</li><li>Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs.">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+isolation+of+neutrophils+from+murine+blood+using+negative+immunomagnetic+separation.">A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation.</a> Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).</li><li>Hasenberg, M., K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).</li><li>Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+antibacterial+host+defense+in+mice+lacking+the+N-formylpeptide+receptor.">Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor.</a> J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).</li><li>Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice.">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).</li><li>Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+and+CXCR4+antagonistically+regulate+neutrophil+trafficking+from+murine+bone+marrow.">CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow.</a> J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).</li><li>Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+innate+immune+responses+in+a+mouse+model+of+invasive+candidiasis.">Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis.</a> J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).</li><li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pouri&#233;, C., Steinckwich, N., Dournon, C., N&#252;sse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils.">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+negative+enrichment+of+CD4++and+CD8++T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail.">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li><li>Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17RA+signaling+reduces+inflammation+and+mortality+during+Trypanosoma+cruzi+infection+by+recruiting+suppressive+IL-10-producing+neutrophils.">IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).</li><li>Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+screen+identifies+reactive+oxygen+species+as+key+regulators+of+neutrophil+chemotaxis.">Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).</li><li>Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roff&#234;, E., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Chemokine+Receptor+Ccr7+Exacerbates+Atherogenesis+in+ApoE-deficient+Mice.">Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice.</a> Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).</li><li>Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+the+reciprocal+production+of+granulocytes+and+lymphocytes+in+bone+marrow.">Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow.</a> J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).</li><li>Berkow, R. L., Dodson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+evaluation+of+mature+neutrophils+from+human+bone+marrow.">Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow.</a> Blood. 68 (4), 853-860 (1986).</li></ol>

Heri præsenterer vi en pålidelig, enkel, hurtig og økonomisk protokol til isolering af store antal neutrofiler fra knoglemarven af ​​mus med høj renhed og levedygtighed under anvendelse af en densitetsgradientcentrifugering tilgang. Når denne protokol udføres korrekt, kan ~ 6-12 × 10 6 neutrofiler udvindes fra en ikke-inficerede mus og så mange som ~ 30-40 × 10 6 neutrofiler kan isoleres fra en mus efter infektion 6. De isolerede neutrofiler er 80-95% rene og&gt; 95% levedyg...

Neutrofiler er de mest udbredte leukocytter hos mennesker. De er det vigtigste cellulære komponent af det medfødte immunsystem og fungere som en første forsvarslinje mod invaderende mikroorganismer. Patienter med erhvervet neutropeni og primære immundefekter, der påvirker neutrofile tal og / eller funktion udvikle livstruende invasive bakterie-og svampeinfektioner, fremhæver betydningen af disse celler i værtsforsvar 1.. Immungenkendelse af invaderende patogener på infektionsstedet ved deres beslægtede mønstergenkendelse receptorer resulterer i induktionen af en organiseret medfødt immunrespons, som fører til sekretion af kemoattraktanter, der genererer en kemotaktisk gradient kan rekruttere neutrofiler fra blodbanen ind i det betændte væv 2 . Efter neutrofiler ind i infektionsstedet, de bliver aktiveret, hvilket fører til cytokinproduktion og chemokin produktion, patogen optagelse og drab via oxidativ og ikke-oxidative migchanisms 3.. Udover deres velkendt rolle i medfødte immunitet, har neutrofile også for nylig blevet vist at spille vigtige roller som initiativtagere på effektive adaptive immunrespons 4.. På den anden side, bortset fra deres beskyttende roller i immunitet neutrofile også medierer vævsskade og immunopatologi grund af overdreven ophobning og / eller aktivering ved steder med inflammation, som vist i en række smitsomme sygdomme og autoimmunsygdomme 5-7. På trods af den uundværlige rolle neutrofiler i montering effektive medfødte immunrespons og deres pleiotropiske effektor funktioner i flere infektionssygdomme og betændelsestilstande tekniske vanskeligheder med håndtering af disse celler og mangel på pålidelige forsøgsprotokoller har hindret forskning neutrofiler over de seneste årtier. Derfor bør brug af reproducerbare assays til isolering af neutrofiler fremme yderligere forskning i neutrofil-medieret immunologiske funktioner ex vivo og in vivo. Til dato har adskillige fremgangsmåder blevet beskrevet til isolering af neutrofiler, såsom densitetsgradientcentrifugering af humant blod og mus blod eller knoglemarv 8,9, positiv eller negativ immunomagnetisk berigelse af neutrofiler fra mus blod eller knoglemarv 10,11, og høst af neutrofiler fra bughulen af mus efter intraperitoneal injektion af Thioglycollat ​​eller andre inflammatoriske midler 12.. Selvom neutrofiler kan let isoleres i store mængder fra humant blod, denne metode er ikke optimal i mus på grund af den begrænsede mængde af museblod der udelukker isolering af tilstrækkelige neutrofiler til funktionelle undersøgelser eller adoptiv overføring eksperimenter 13.. Desuden celler fra bughulen selvom udbyttet af Thioglycollat-fremkaldte er større sammenlignet med mus blod, renheden af ​​neutrofiler i inflammatoriske peritoneumudskylning varierer mellem60-90%, og de isolerede neutrofiler udviser en aktiveret fænotype. Således opsamles cellerne ved hjælp af denne metode kan kun bruges til at udføre funktionelle studier af aktiverede, men ikke af ustimulerede neutrofiler, som musen bughulen har få neutrofiler ved steady state 12. I stedet knoglemarven er en bekvem reservoir til høst stort antal enten stimulerede eller aktiverede neutrofiler 11,14, som derefter kan bruges til efterfølgende funktionelle undersøgelser såsom fagocytose, drab og degranulation eller til adoptiv overførsel til recipientmus. Heri beskriver vi en enkel og hurtig (~ 2 hr) protokol, der giver et højt udbytte (~ 6-12 × 10 6 neutrofiler / ikke-inficerede mus, eller op til 30-40 × 10 6 neutrofiler / inficerede mus) ren (80 -95%) neutrofiler med&gt; 95% levedygtighed fra knoglemarven. Denne metode bruger kommercielt tilgængelige Histopaque, som er densitetsgradient celle særskiltration medier bestående af Ficoll og natrium diatrizoat, at adskille neutrofiler fra knoglemarven hos mus. Denne metode giver betydeligt større antal neutrofiler pr mus sammenlignet med blod eller bughulen, kan det bruges til at indsamle neutrofiler fra mus både ved steady state eller efter infektion, og det er lettere at lag i forhold til densitetsgradientcentrifugering metode, der bruger diskontinuert Percoll gradienter bestående af 55% / 65% / 75% Percoll i PBS 9.. Desuden er den tid og de ressourcer, der kræves for at indsamle rene neutrofile faldet betydeligt i forhold til neutrofil isolation hjælp fluorescens-aktiveret celle sortering. Også fordi denne metode ikke indebærer en immunomagnetisk berigelse trin, det er mere omkostningseffektivt, og den undgår eksponering af celler til den magnetiske spalte og antistoffer og derved mindske sandsynligheden for neutrofilaktivering. Ud over at udføre funktionelle undersøgelser af isolerede neutrophils ex vivo og adoptiv overførsel af celler i recipientmus, denne protokol beskriver også en metode til mærkning af isolerede neutrofiler ved hjælp af forskellige CellTracker farvestoffer. Differential mærkning af neutrofiler fra mus af forskellige genetiske baggrunde kan tilpasses i konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser til sporing af overførte neutrofiler i væv af recipientmus ved anvendelse af flowcytometri, som kan give mekanistisk indsigt om direkte rolle af specifikke gener i handel med neutrofiler fra blodet i mål betændte organer 6..

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
 <td>GemCell</td>
 <td>100500</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td>Quality Biological Inc</td>
 <td>351-027-101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3624</td>
 <td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1077</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>10771</td>
 <td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1119</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>11191</td>
 <td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>210-40-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
 <td>The Warner Graham Company</td>
 <td>64-17-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-7025</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-2927</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>170451-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>551461</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>560599</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>47-0112-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>553141</td>
 <td>Use at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-23105</td>
 <td>Use at 1:1000 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
 <td>USB Corporation</td>
 <td>19943</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Taconic</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430053</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml centrifuge tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229225B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229210B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229205B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes (3 ml)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>357575</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 ml syringes</td>
 <td>Kendall monoject</td>
 <td>512878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
 <td>BD</td>
 <td>305122</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm cell strainers</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352360</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bactericidal Petri dishes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>351029</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Combitips Plus Biopur</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>2249608-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td>
 <td>Biomedical Research Instruments</td>
 <td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td>
 <td>Instruments sterilized prior to use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>The Baker Company</td>
 <td>SG403</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated centrifuge</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>75004521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37 &deg;C shaking water bath</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>3166721</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

Neutrofiler er kritiske effektorceller i det medfødte immunsystem. De er hurtigt rekrutteret på steder af akut inflammation og udøve beskyttende eller patogene virkninger afhængigt af den inflammatoriske miljø. Ikke desto mindre er trods den uundværlige rolle neutrofiler i immunitet, detaljeret forståelse for de molekylære faktorer, der medierer neutrofiler &#39;effektor og immunopathogenic effekter i forskellige smitsomme sygdomme og inflammatoriske tilstande stadig mangler, dels på grund af deres korte halveringstid, vanskelighederne med håndtering af disse celler og mangel på pålidelige forsøgsprotokoller for at opnå et tilstrækkeligt antal neutrofiler for downstream funktionelle undersøgelser og adoptiv overførsel eksperimenter. Derfor enkel, hurtig, økonomisk og pålideligt metoder er særdeles ønskeligt for at høste tilstrækkeligt antal mus neutrofiler til vurdering af funktioner såsom fagocytose, drab, cytokinproduktion, degranulation og menneskehandel. Med henblik herpå,præsenterer vi en reproducerbar densitetsgradientcentrifugering-baseret protokol, der kan tilpasses i alle laboratorier at isolere et stort antal neutrofiler fra knoglemarven hos mus med høj renhed og levedygtighed. Desuden præsenterer vi en enkel protokol, der anvender CellTracker farvestoffer til at mærke de isolerede neutrofiler, som derefter kan adoptivt overføres til recipientmus og spores i flere væv i mindst 4 timer efter overførsel ved anvendelse af flowcytometri. Med denne fremgangsmåde kan differentieret mærkning af neutrofiler fra vildtype-og-gendeficient mus med forskellige CellTracker farvestoffer held kan anvendes til at udføre konkurrencedygtige genudsættelse undersøgelser for at vurdere den direkte rolle af specifikke gener i handel med neutrofiler fra blodet ind i målvæv in vivo .

Denne protokol er optimeret til høst af knoglemarvsceller fra mus og den efterfølgende adskillelse af neutrofiler fra disse celler ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af kommercielt tilgængelige Histopaque celleadskillende medier. Neutrofiler isoleres ved anvendelse af denne metode kan anvendes til en række aftagere funktionelle studier ex vivo og til adoptiv transfer eksperimenter i recipientmus. Den typiske udbytte af indsamling af knoglemarvsceller fra både ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments at JoVE.com

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Vi beskriver en protokol til isolering og oprensning af neutrofiler fra mus knoglemarv ved densitetsgradientcentrifugering og neutrofil mærkning hjælp CellTracker farvestoffer. Dette udgør en enkel, hurtig, reproducerbar og økonomisk metode til opnåelse af store antal neutrofiler til downstream funktionelle undersøgelser eller adoptiv overførsel og sporing eksperimenter.

Isolation, rensning og mærkning af museknoglemarv Neutrophils for Funktionelle Studier og adoptiv overføring Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Sporing Mouse knoglemarv Monocytter<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Lang Bone Dissektion og knoglemarv Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering og karakterisering af neutrofile-afledte mikropartikler for funktionelle studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...