Name: robust 3d dna fish using directly labeled probes
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل BBSRC ويلكوم ترست. ونود أن نشكر سايمون ووكر للحصول على المساعدة مع التصوير وفيليكس كروجر للمساعدة في تحليل المعلوماتية الحيوية.

<ol>
	<li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+transcription:+shaping+the+landscape+of+the+genome.">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+3C+technologies:+insights+into+nuclear+organization.">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2000).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li><li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li><li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+(3D-FISH.">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li><li>Solovei, I., Beatty, B., Mai, S., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+on+three-dimensionally+preserved+nuclei.">FISH on three-dimensionally preserved nuclei.</a> FISH: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status.">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983 (2012).</li><li>Solovei, I., Cremer, M., Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+Cultured+Cells+Combined+with+Immunostaining.">3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining.</a> Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications. , (2010).</li></ol>

وقد رعت إنتاج هذه المادة جزئيا بواسطة كارل زايس وMetaSystems.

أصبح FISH DNA 3D أداة المعترف بها على نطاق واسع لتحليل الترتيبات المكانية في النواة. بينما FISH يوفر نتائج البصرية ومباشرة، كما هو الحال مع كل تقنية، ويحتاج المرء أن يكون مدركا لحدوده. يواجه FISH DNA المشكلة الكامنة أن هناك حاجة إلى علاجات قاسية نسبيا لجعل لونين للوصول للتحقيقات السمك الذي يعطل في النهاية النووية هيكل الشيء الذي هو ليتم تحليلها. اتبعت عدة استراتيجيات لتزييف الوصول والحفاظ على هيكل. في بروتوكول الموصوفة هنا، يتم الوصول إليها عن طريق الحمض النووي الكروموسومات permeabilization تجميد ذوبان الجليد من الخلايا وتمسخ الحرارة قبل التهجين التحقيق. Solovei، وآخرون، (2002) بتحليل التغيرات الهيكلية بعد معاملة مماثلة، ووجدت أن متوسط ​​النزوح من المجالات لونين كان 300 نانومتر مما يحد القرار من التحليل البنيوي إلى ما يقرب من 1 ميغابايت في مناطق الجينوم 8. في حين أن هذا ليس ارتفاع القرار، وذلكهو مقياس معقول لتحليل الموقف النووي. وهناك اعتبار أكثر عملية للتحليل FISH هو أن الحصول على الصور وقياسات للمسافات النووية هي العمليات تستغرق وقتا طويلا مما يحد من عدد النوى التي يمكن تحليلها. من أجل دراسة الأحداث نادرة كنا نهدف إلى القيام عالية الإنتاجية التصوير الآلي. ثم، مع وجود ضوابط مناسبة في مكان، بأعداد كافية ويمكن مقارنة للسماح للتحليل الإحصائي قوية من العلاقات المكانية. نحن نحلل بشكل روتيني 600 نواة لكل نقطة البيانات التي لدينا تحديد إحداثيات 3D من جميع الاشارات FISH ضمن وحدة التخزين النووي. تتطلب هذه البيانات مساحة التخزين القليل جدا، والسماح لتحليل المسافات بين وداخل أليلية، أو مواقف شعاعي في أي نقطة في وقت لاحق. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يتم التجهيز الآلي بطريقة الباحث الأعمى الذي يقلل بدرجة كبيرة من احتمال التحيز اللاوعي. لتمكين هذا النوع من analys إنتاجية عاليةهو، كان هدفنا لإقامة وسيلة سريعة وفعالة لأداء FISH الحمض النووي. وجدنا بروتوكول الموصوفة هنا أن تكون قوية للغاية، وتنتج باستمرار إشارات مشرق مع خلفية منخفضة. لأنها عملت كل أنواع الخلايا حاولنا شريطة أن تتكيف الخطوة من ربط الخلايا على الشريحة. وعلاوة على ذلك، مع استثناء واحد، كل تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي كنا يمكن أن تتحول إلى تحقيقات مشرق. ونحن أيضا الكشف بنجاح عددا من البروتينات النووية من قبل تلوين الأجسام المضادة بعد FISH الحمض النووي. بينما لبعض البروتينات هذا يعمل بشكل جيد، ونحن نوصي مقارنة مع التقليدية المناعي (IF) لضمان الاتساق في نمط تلوين الأجسام المضادة بين IF والحمض النووي المناعية FISH (قارن 11). عموما، وجدنا أن تحقيقات المسمى في الألوان المختلفة التي تنتج نفس النتائج. ومع ذلك، ينبغي النظر في الجوانب التالية عند اختيار الصبغة وضع العلامات. أولا، ولون من fluorophore يجب أن يكون كشفها بشكل جيد من قبل يو المجهرااا. ثانيا، يتعين على الطول الموجي للضوء المنبعث من fluorophores تكون مختلفة بما فيه الكفاية لتجنب تنزف من خلال في القناة الأخرى. وهذا يعتمد على عوامل التصفية في المجهر. والثالث، على الأقل في أيدينا، وبعض الألوان تنتج إشارات مشرق أكثر اتساقا من غيرهم. وقد استخدمنا دائما دابي (الأزرق) على أنه مباين مما يجعل اليكسا فلور 555 (الحمراء)، 488 (أخضر)، و647 (الحمراء بعيدة) خيارات جيدة لوصفها تحقيقات. مع نظام التصوير لدينا، وجدنا اليكسا فلور 555 (الحمراء) لإنتاج ألمع الإشارات، تليها اليكسا فلور 488 (أخضر). فلور اليكسا 647 (بعيدا الحمراء) لديه عيب وأنه لا يمكن الكشف عنها بواسطة العين البشرية وبالتالي عدم وجود إشارات يمكن أن ينظر إليه عند النظر إلى أسفل المجهر. وبالتالي، إذا فعل FISH اللونين، نوصي مزيج من الأصباغ الحمراء والخضراء. قد تنشأ اثنين من المشاكل الرئيسية: الخلايا غسل قبالة الشرائح والإشارات الضعيفة. كيف الخلايا جيدا التمسك الشريحة هو betw متغير بشكل كبيرأنواع الخلايا التابعين، وأفضل بروتوكول لتسوية / بذور الخلايا يحتاج يحدد لاحقا. لقد استخدمت بنجاح إما موجبة أو الشرائح المغلفة بولي-L-يسين (اشترى جاهزة للاستخدام)، ولكن العثور على خلايا الالتزام عموما أفضل على الشرائح المغلفة بولي-L-يسين. وجدنا أيضا أنه عندما كانت خلايا من شأنه مناطق بأكملها كثيفة جدا تقشر ورقة، في حين كان يعوق التصوير الآلي إذا كانت الخلايا متفرق جدا. وبالتالي، إذا كانت العينة ليست ثمينة جدا، وينبغي أن يكون المصنف أعداد مختلفة من الخلايا لتحديد كثافة مثالية. إذا الخلايا عرضة ليغسل بشكل خاص، قلم حاجز مسعور يمكن استخدامها، ويمكن تنفيذ الخطوات FISH من قبل pipetting بعناية حلول مباشرة على الشريحة. pipetting لأيضا يقلل بشكل كبير من حجم الكواشف اللازمة، ولكنه يأخذ فترة أطول بكثير عند القيام عدة شرائح. الإشارات الضعيفة وعادة ما تكون بسبب تحقيقات الفقراء، وأنها تستحق استثمار الوقت في صنع الجيد منها. نظيفة BAC الحمض النووي ينبغي استخدامد في بدء المواد التي يمكن الحصول عليها عن طريق الترسيب المتكررة أو مجموعات المتاحة تجاريا. التلوث مع الحمض النووي الجيني البكتيري يؤثر سلبا على نوعية التحقيق ومعالجة متأنية خلال تحلل الخلايا وتصفية من المحللة الخلية هو مطلوب للحفاظ على الحد الأدنى. هو عليه، ومع ذلك، ليس من الضروري استخدام خطوة نوكلياز خارجية لهضم الحمض النووي الخطية، لأن هذا يقلل بدرجة كبيرة من المحصول. وضع العلامات كفاءة لجنة التحقيق أمر بالغ الأهمية. مراقبة الجودة الأكثر أهمية لهذه الخطوة هو التحقق من حجم شظية بعد نيك ترجمة (انظر ممثل النتائج). سوف مسحة &#39;جيدة&#39; يؤدي دائما تقريبا في التحقيق الملونة الزاهية. ومع ذلك، فقد وجدنا أن في بعض الأحيان على بعض BAC لا يمكن معالجتها في تحقيق جيد، وBAC مختلفة تحتاج إلى أن يتم اختيار. خطوة هامة أخرى هي تمسخ الحرارة. إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جدا، فإن الحمض النووي أن يكون إلا جزئيا والتشويه والتحريف، سوف تضعف والتهجين التحقيق. إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدا وبناء واي النوويةسوف يكون قلق أكثر من اللازم. في أيدينا، 78 ° C على كتلة الساخنة المقلوب هو الحل الوسط المثالي، ولكن هذا قد تختلف اعتمادا على كتلة الساخنة منها استخدامها. لقد حققنا نتائج جيدة باستخدام Vectashield المتوسطة المتزايدة، ولكن وجدت أن SlowFade الذهب لديه أقل الخلفية ويحافظ على إشارة الفلورسنت لمدة أطول. نحن لا نوصي باستخدام الصلب مجموعة المتوسطة المتزايدة كما وجدنا أن يؤثر ذلك على هيكل 3D وتشكيل فقاعات الهواء مع مرور الوقت. في الختام، الزاهية الفلورسنت تحقيقات صفت مباشرة مع بروتوكول FISH الحمض النووي الموصوفة هنا نقدم حلا فعالة لتحليل قوي وسريع للهندسة النووية والتي تنطبق على طائفة واسعة من المسائل البيولوجية.

الحمض النووي مضان التهجين في الموضع (FISH DNA) يسمح التصور ثلاثي الأبعاد من مواضع الجينات الفردية، المجالات subchromosomal والكروموسومات حتى بأكمله خلال جميع مراحل دورة الخلية. يستخدم FISH 2D للدراسات الطورية بينما السمك 3D وقد استخدم على نطاق واسع للتحقيق في العلاقة بين التنظيم المكاني للجينوم وظيفتها أثناء الطور البيني (1،2 والمراجع فيه). تاريخيا، تم إجراء دراسات المشارك جمعية عن طريق التحقيق في عشرات ومئات من مواضع الفردية من قبل الأسماك. وقد وضعت أكثر قوة في الآونة الأخيرة تقنيات عالية الإنتاجية المستندة إلى 3C مثل 4C ومرحبا-C 3، مما يسمح التحقيق في الجزيئية عبر الحديث بين عدة آلاف من مواضع مختلفة. في حين التقنيات المعتمدة على 3C والأسماك الحمض النووي يمكن أن تكون أساليب تكميلية، فإنها لا تجيب بالضرورة نفس الأسئلة. على أساس أساليب 3C توفير قراءات الفرقة من السكان الخلية المختلطة، مما أدى إلى probabilإيتي لمشاركتها في الجمعيات. في المقابل، في حين انخفاض في الإنتاجية، التقنيات المعتمدة FISH توفر إمكانية لتحليل الترتيبات المكانية من مواضع أو الكروموسومات في الخلايا الفردية وفقا لنمو أو خلية مراحل دورتهن. وبالتالي، سوف FISH الاستمرار في أن تكون أداة هامة لبحث العلاقات هيكل الوظائف النووية. هناك نوعان من الاعتبارات الرئيسية في أداء ناجح التجارب السمك 3D. هذه هي: 1. الحصول على تحقيقات المسمى على النحو الأمثل و2. اختيار العلاجات الخلوية، بما في ذلك التثبيت، وقبل خطوات ما بعد التهجين، للحفاظ على مورفولوجيا النووية قدر الإمكان في حين جعل الحمض النووي يمكن الوصول إليها بما فيه الكفاية لتهجين التحقيق. وضع العلامات التحقيق كفاءة من المهم للغاية بالنسبة للأسماك. تقليديا، وقد استخدمت نيك الترجمة لعرض إما ناشبة أو النيوكليوتيدات fluorophore مترافق 4. وبالمثل، هي مجموعات نيك الترجمة التجارية المتاحة للناشبة مباشرة أو دمج fluorophore، بور أيضا لوضع العلامات على مرحلتين باستخدام النيوكليوتيدات aminoallyl والأصباغ أمين التفاعلي. وهذا الأخير يجعل التأسيس صبغ أكثر كفاءة من خلال إعطاء البلمرة DNA جزيء أقل حجما للعمل مع. وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير مجموعات لوضع العلامات غير الأنزيمية من الحمض النووي التي تستغل ملزم التنسيقية للالبلاتين إلى الأحماض النووية. يمكن حتى تحقيقات FISH شراؤها صفت بالفعل 5. بينما مجموعات وتحقيقات تصنيعها تجاريا لا شك يعطي سهولة الاستخدام، فهي أكثر تكلفة بكثير من شراء المكونات الفردية وإنتاج تحقيقات في المنزل. نحن الأمثل بروتوكول ترجمة نيك منخفضة التكلفة من أجل تسمية مباشرة العديد من تحقيقات BAC مختلفة في ألوان متعددة. اكتشفنا أن الحصول نقية للغاية DNA BAC أمر بالغ الأهمية والنتائج في اشتراط فقط 10-20 نانوغرام من مسبار لكل شريحة FISH، مقارنة ب 10 - 20 أضعاف أكثر عند استخدام نجس الحمض النووي القالب، مما أدى إلى كبرى من حيث التكلفة والوقت الادخار. استخدام الأميني allyldUTP يسمح وضع العلامات مرنة منتحقيقات مع الأصباغ المتاحة أمين التفاعلي (مثل اليكسا فلور أو قبرصي، صبغ) أو الأنواع ل(مثل البيوتين، digoxigenin). تم الكشف عن تحقيقات ناشبة المسمى من قبل الأجسام المضادة، مترافق fluorophore أو streptavidin لتضخيم وتصور إشارة. مشرق تحقيقات صفت مباشرة تظهر عادة أقل تلوين الخلفية وتجنب الإفراط في تضخيم الإشارات، وبالتالي يؤدي إلى تمثيل أكثر دقة للتوطين النووية والتشكل مكان. هناك العديد من التقنيات الأسماك المختلفة التي تستخدم مثبتات مختلفة، ما قبل العلاج، ويغسل بعد التهجين ولكن هذه تندرج عموما في الفئات التالية: تثبيت غلوتارالدهيد مع هيدروكسيد الصوديوم تمسخ، تثبيت الفورمالديهايد مع حمض الهيدروكلوريك تمسخ، وتثبيت الفورمالديهايد مع تمسخ حرارة 6-9 . كل من هذه مزاياه وعيوبه. النتائج تثبيت غلوتارالدهيد في المحافظة جيدة الهيكلية النووية، ولكنها تتطلب العلاج مع عوامل الاختزال إلى تقليلتألق ذاتي الناتجة عن ذلك، والعلاج هيدروكسيد الصوديوم يحتاج إلى أن تسيطر عليها بعناية لتحقيق التوازن تمسخ الحمض النووي كافية والأضرار المحتملة لهيكل النووية 6. تثبيت الفورمالديهايد هو أقل قوة، وهو ما يعطي احتمال زيادة الاضطرابات العمارة النووية، ولكن أيضا عادة إشارات أقوى وأكثر موثوقية وأقل تألق ذاتي 9. حمض الهيدروكلوريك العلاج depurinates الحمض النووي والبروتينات من الشرائط، وتوفير سهولة الوصول إلى الحمض النووي للتحقيقات، ولكن قد يعرض أيضا فواصل الحمض النووي. التدفئة يفصل جسديا حمض النووي، الذي أسفر عن هدف جيد التهجين وإشارات قوية ولكن يمكن أن يسبب بعض الاضطراب من هيكل النووية 8. الدرجة التي كل من هذه التقنيات تؤثر الحواتم بروتين تختلف على نطاق واسع 6،9، مما أدى إلى الشرط لتحديد تجريبيا لكل بروتين بروتوكول الأمثل لاستخدامها في التجارب المناعية FISH. في حين ليس هناك &#39;الكمال&#39; الحمض النووي FISH الشركة المصرية للاتصالاتchnique، أنها يمكن أن تكون مفيدة إذا كل تسيطر عليها بشكل جيد. كان هدفنا لتحسين بروتوكول للقوة واستنساخه FISH الحمض النووي للتحقيق لتحديد المواقع المكانية للمواضع متعددة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا 10، مع التركيز على طريقة التدفئة بالنسبة لمعظم إشارات موثوقة. مع هذا، واستخدام نظام التصوير الآلي نحن تهدف إلى زيادة الإنتاجية للتحليل خلية واحدة من الترتيبات النووية.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NTB buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>D-1532</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs</td>
 <td>Bioline</td>
 <td>BIO-39025</td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aminoallyl-dUTP</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM8439</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA Polymerase I</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M02095</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase I recombinant RNase free</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4716728001</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR purification kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104</td>
 <td>Step 1.1.4, 1.2.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOAc</td>
 <td>VWR</td>
 <td>27653</td>
 <td>Step 1.1.5, Step 2.1.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S5761</td>
 <td>Step 1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications</td>
 <td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
 <td>A32750, A32756, A32757</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO (anhydrous) </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>276855</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
 <td>Life Technologies </td>
 <td>S33102</td>
 <td>Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cot-1 DNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18440-016</td>
 <td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single stranded DNA from salmon testes </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>D7656 </td>
 <td>Step 2.1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized formamide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-9037</td>
 <td>Step 2.1.1.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate</td>
 <td>Sigma Life Sciences</td>
 <td>D8906 </td>
 <td>Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XMP painting probes</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td>000000-0528-837</td>
 <td>Step 2.1.1.4 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine coated slides</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P0425</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrophobic pen (ImmEdge)</td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>H-4000</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m sieve (Mouse fetal liver cells only)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352350</td>
 <td>Step 2.1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P6148 </td>
 <td>Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Cl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saponin from Quillaja bark</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T9284 </td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Life Technologies (GIBCO)</td>
 <td>70011-036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>G/0650 </td>
 <td>Step 2.1.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20252</td>
 <td>Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47670</td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SSC</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 22</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022022A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 50</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022050A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rubber cement</td>
 <td>Marabu</td>
 <td>2901 (10 000)</td>
 <td>Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen Molecular Probes</td>
 <td>D3571</td>
 <td>Step 2.2.8 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlowFade Gold</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S36936</td>
 <td>Step 2.2.10 (mounting medium)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear nail polish</td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.2.10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nanodrop 2000</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td>
 <td>GE Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coplin jars</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td>
 <td>Step 2.1.3 onwards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen dewar </td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Base with Black Lid (light-tight chamber)</td>
 <td>Simport</td>
 <td>M920-2</td>
 <td>Step 2.1.17</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer comfort</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5355 000.011</td>
 <td>Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 &deg;C room)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Imaging and Image processing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metafer - Imaging Automation Platform</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axio Imager Z2 upright</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>epifluorescence microscope used with automated imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IX81 confocal microscope (FV1000)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>confocal microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bitplane, version 7.3</td>
 <td>Imaris</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and 3D modeling software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scientific volume Imaging, version 4.1</td>
 <td>Huygens</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and deconvolution software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 FISH buffers and reaction mixes 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Composition</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x NTB buffer</td>
 <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.05 M MgCl2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mg/ml BSA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix</td>
 <td>0.5 mM dGTP</td>
 <td>Store 50 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dATP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dCTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.125 mM dTTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 % PFA</td>
 <td>Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 &deg;C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA.</td>
 <td>Store 50 ml aliquots at -20 &deg;C, do not re-freeze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 % saponin solution</td>
 <td>Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. </td>
 <td>Store 5 ml aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 x SSC</td>
 <td>Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate mix</td>
 <td>20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight.</td>
 <td>Store 500 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>

robust 3d dna fish using directly labeled probes

أصبح FISH DNA 3D أداة رئيسية لتحليل منظمة ثلاثي الأبعاد للنواة، ونشرت العديد من الاختلافات من هذه التقنية. في هذه المادة ونحن تصف البروتوكول الذي تم الأمثل لمتانة، استنساخ، وسهولة الاستخدام. يتم إنشاؤها الزاهية الفلورسنت تحقيقات صفت مباشرة من قبل نيك الترجمة مع الأميني allyldUTP تليها اقتران الكيميائية للصبغ. يتم تنفيذ 3D FISH الحمض النووي باستخدام خطوة تجميد أذاب لpermeabilization الخلية وخطوة التسخين لتمسخ في وقت واحد من التحقيق والدنا النووي. البروتوكول ينطبق على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ومجموعة متنوعة من المسابير (تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي، البلازميدات، fosmids، أو دهانات كروموسوم الجامعة) ويسمح للتصوير الآلي عالية الإنتاجية. مع هذا الأسلوب بشكل روتيني ونحن التحقيق في توطين النووية لمدة تصل إلى ثلاث مناطق الكروموسومات.

بروتوكول الموصوفة هنا (الشكل 1 لمحة عامة) وقد استخدمت لتأثير كبير على الجمع بين الحمض النووي FISH مع الإنتاجية العالية التقاط الصور للتحليل من منظمة الجينوم. الجيل تحقيقات نوعية جيدة أمر بالغ الأهمية لنجاح (انظر المناقشة). الشكل 2 يوضح اثنين من ضوابط الجودة مهمة لتحقيقات FISH. بعد نيك الترجمة، يجب أن مسحة من الحمض النووي تكون واضحة مع الجزء الأكبر من شظايا تشغيل ما بين 150 و 700 سنة مضت (الشكل 2A). بعد اقتران الكيميائية، إدماج صبغة الفلورسنت يمكن قياسه من خلال التحليل الطيفي لجنة التحقيق (الشكل 2B). عند استخدام تحقيقات جيدة، بعد بروتوكول FISH DNA عادة ما ينتج في إشارات FISH DNA مشرق على خلفية منخفضة. وقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول على مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا، وإما مع المجاهر برنامج التحصين الموسع ومضان أو متحد البؤر. التصوير الآلي باستخدام برنامج التحصين الموسع-fluorescenc<html> ه المجهر يتطلب، إشارات FISH يسهل التعرف عليها حاد مع الخلفية قليلا (الشكل 3)، في حين أن الفحص المجهري متحد البؤر يتطلب إشارات أكثر كثافة. الشكل 4A يظهر ممثل الصور ومعالجتها. ويمكن الحصول على إحداثيات النووية من إشارات FISH، والعلاقات المكانية من مناطق الجينوم يمكن حسابها (للحصول على مثال انظر الشكل 4B). وقد استخدمنا أيضا مداخن صورة تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ل 3D النمذجة من إشارات FISH داخل الأراضي كروموسوم الخاصة بهم (فيلم 1). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> الشكل 1. ويبين سير العمل لوضع العلامات التحقيق والأسماك الحمض النووي. إعداد دقق في الزرقاء. ويرد الإجراء FISH DNA باللون الأسود مع التفاصيل الواردة في اللون الأخضر. = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> الشكل 2. وضع العلامات تحقيقات من قبل نيك الترجمة ومراقبة الجودة من تحقيقات المسمى. A) جل تظهر مسحة مثالية قبل التسخين لتعطيل الدناز الأول (حارة 1: سلم الحمض النووي، لين 2 و 3: تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي بعد نيك الترجمة). يجب أن تكون شظايا في BP مجموعة 150-700. كثيرا ما لوحظ حدوث تشويه إضافية في ~ 1 كيلو بايت مع ردود الفعل نيك الترجمة الناجحة. B) Microvolume تحليل الطيف الكامل للتحقيقات المسمى. ويلاحظ وجود ذروة الحمض النووي في 260 نانومتر مع ذروة الثانية المقابلة لطول الموجة الامتصاصية من fluorophore هو المسمى التحقيق مع: اليكسا فلور 488: 495 نانومتر، اليكسا فلور 555: 555 نانومتر، اليكسا فلور 647: 650 نانومتر. المعروضة هي ثلاثة تحقيقات مع إدماج جيدة: قمم الامتصاصية fluorophore هي ارتفاع مماثل أو أعلى من القمم الحمض النووي. اليكسا فلور 647 لديه عادة أعلى الامتصاصيةمن اليكسا فلور 555، والتي بدورها لديها الامتصاصية أعلى من فلور اليكسا 488. اليكسا فلور 488 أيضا يمتص بعض الضوء في 260 نانومتر، ومن هنا جاءت الذروة الأولى لهذا التحقيق هو أعلى من الآخرين. تحقيقات مع الفقراء إدراج عرض fluorophore الامتصاصية 2-3 أضعاف أقل من امتصاص الحمض النووي. تحقيقات مع أكثر من ذروة fluorophore أعلى 2 أضعاف من ذروة DNA تحتوي عادة صبغ اللامقترن التي قد تسبب الخلفية في الأسماك. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> الشكل (3). لقطة شاشة من برنامج التصوير السمك 3D MetaCyte تظهر تجربة FISH ثلاثة ألوان نموذجية. وتنقسم الشاشة إلى عدة أجزاء. A) حقل من رأي (فوف) الصورة الخام التي تلتقطها Metafer / MetaCyte نظام مسح الشريحة. B) معرض من الصور التي تم تحديدها من نوى أن يكون للأمم المتحدة<html> dergone معالجة الصور وتجزئة للإشارات FISH. يمكن عرض أنواع مختلفة من البيانات على كل صورة معرض. في هذا المثال عدد الخلايا يظهر أعلى يسار مع مختلف والمسافات بين الألائل interlocus اليمنى العليا وعلى جانبي أسفل كل صورة. C) اسم الشرائح مع عدد من النوى التي تم تحديدها في التحليل. D) تصوير من الشريحة مع المنطقة الممسوحة ضوئيا من قبل نظام. E) توسيع المنطقة الممسوحة ضوئيا. بقع بيضاء تمثل نواة المحددة في مجال الرؤية. F) البيانات التي تتم معالجتها. في هذا المثال يتم عرض المسافات بين الألائل القصوى بين الإشارات الخضراء (أعلى) والإشارات الحمراء (القاع). البيانات المعروضة من P20 الخلايا الجرثومية الماوس. وتقع على الكروموسومات تحقيقات مختلفة، وتغطي سداسي البروم ثنائي الفينيل والجينات HBA وكتلة هيستون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . . ضمن الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> الشكل 4. أمثلة من الصور المجهزة والبيانات الموضعية مشتقة. A صور) المجهزة للE13.5 الماوس خلايا الكبد الجنين ملطخة تحقيقات BAC تقع على الكروموسومات المختلفة التي تغطي MYC وKcnq1 الجينات (وهو ما يسمى MYC وKvDMR، الملونة الخضراء والحمراء، على التوالي). B) توكي المؤامرات مربع ضئيلة للغاية تمثل المسافة بين الألائل توزيع لنفس مواضع في 600 نواة. يتم رسم مسافة بين الألائل ككسر من نصف قطر نواة &#39;(المسافة / دائرة نصف قطرها) لحساب التغيرات في حجم النووية. ES نوى الخلايا لديها دائرة نصف قطرها حوالي 5 ميكرون. تحقيقات الأحمر بشكل ملحوظ أقرب معا من تحقيقات الخضراء (***: P &lt;0.01، المفردة اختبار t). البيانات من 10. الفيلم 1. 3D النمذجة اثنين من مواضع داخل كروموسوم ر بهمerritory. وصفت تحقيقين BAC تقع على مقربة من طرفي كروموسوم الماوس 7 (الأحمر وحتى الأحمر، (أبيض الزائفة ملونة)) وتهجين جنبا إلى جنب مع الطلاء كروموسوم كامل (الأخضر) إلى خلايا ES الماوس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes at JoVE.com

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

نحن تصف بروتوكول قوية وتنوعا لتحليل العمارة النووي DNA من قبل الأسماك 3D باستخدام تحقيقات الفلورسنت صفت مباشرة.

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

الحمض النووي القائم على تحديد الأنواع السمكية البروتوكول

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين (FISH) لدراسة كروموسوم X التعطيل في المتباينة أنثى الفأر الخلايا الجذعية الجنينية

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

تجميع لتحويل الطول الموجي تهجين الحمض النووي تحقيقات باستخدام صامد Cyanine الأصباغ

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

تقييم الحيوانات المنوية الأسماك باستخدام برامج وأجهزة التبريد

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...