Name: robust 3d dna fish using directly labeled probes
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes at JoVE.com

Эта работа финансировалась BBSRC и Wellcome Trust. Мы хотели бы поблагодарить Саймон Уокер за помощь в визуализации и Феликс Крюгер за помощью биоинформатики анализа.

<ol>
	<li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+transcription:+shaping+the+landscape+of+the+genome.">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+3C+technologies:+insights+into+nuclear+organization.">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2000).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li><li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li><li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+(3D-FISH.">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li><li>Solovei, I., Beatty, B., Mai, S., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+on+three-dimensionally+preserved+nuclei.">FISH on three-dimensionally preserved nuclei.</a> FISH: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status.">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983 (2012).</li><li>Solovei, I., Cremer, M., Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+Cultured+Cells+Combined+with+Immunostaining.">3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining.</a> Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications. , (2010).</li></ol>

Производство этой статьи был частично финансировалось Zeiss Карл и MetaSystems.

3D FISH ДНК стала широко признанным инструментом для анализа пространственных механизмов в ядре. В то время как рыба обеспечивает визуальное и непосредственные результаты, как с каждым технику, нужно быть в курсе свои ограничения. ДНК FISH сталкивается с проблемой, которая присуща относительно суровых лечения необходимы, чтобы сделать доступными для хроматина FISH зондов, которые в конечном итоге разрушает структуры ядра-то самое, что должен быть проанализирован. Несколько стратегии были преследовали жонглировать доступность и сохранение структуры. В протокол, описанный здесь, хромосомную ДНК, становится доступной на замораживание-оттаивание проницаемости клеток и тепловой денатурации до гибридизации зонда. Соловей и др.., (2002) проанализированы структурные изменения после подобного лечения и обнаружили, что среднее смещение доменов хроматина составлял 300 нм, что ограничивает разрешение структурного анализа примерно 1 Мб регионов в геноме 8. Хотя это не высокое разрешение, оноэто разумный масштаб для анализа ядерных положение. Более практичным учетом FISH анализа заключается в том захвата изображений и измерения ядерного расстояния являются трудоемкими процессами, которые ограничивают число зародышей, которые могут быть проанализированы. С целью изучения редких событий и надо достичь высокой пропускной способности автоматизированной обработки изображений. Затем, соответствующий контроль на месте, достаточного числа можно сравнивать, чтобы обеспечить надежный статистический анализ пространственных отношений. Мы регулярно анализируем 600 ядер на каждую точку данных, для которых мы 3D координаты всех FISH сигналов в пределах объема ядра. Эти данные требуют очень мало места для хранения и позволяют анализировать меж-и внутри-аллельных расстояния, или радиальные положения впоследствии в любой точке. Кроме того, автоматизированная обработка может быть сделано в исследователя слепым способом, который значительно снижает вероятность смещения бессознательного. Чтобы включить этот вид высокой пропускной Analysесть, наша цель заключается в создании быстрый и эффективный способ выполнения ДНК FISH. Мы обнаружили, что Протокол, описанный здесь, чтобы быть чрезвычайно надежной, последовательно производству ярких сигналов с низким фоном. Он работал для всех типов клеток, мы попытались условии, что мы адаптировали шаг прикрепления клеток к слайду. Кроме того, за одним исключением, все мы использовали ВАС может быть превращен в яркое зондов. Мы также успешно обнаружен количество ядерных белков антител после окрашивания ДНК FISH. Хотя для некоторых белков это работает хорошо, мы рекомендуем сравнению с традиционными иммунофлюоресценции (ИФ) для обеспечения согласованности модели окрашивания антителами между IF и ДНК иммуно FISH (ср. 11). Как правило, мы обнаружили, что зондов, меченных в разных цветах производятся те же результаты. Тем не менее, следующие аспекты должны учитываться при выборе маркировки краситель. Во-первых, цвет флуорофора должен быть хорошо обнаруживается микроскопом уСЕПГ. Во-вторых, от длины волны света, излучаемого флуорофоров должны быть достаточно различными, чтобы избежать протечки в другом канале. Это будет зависеть от фильтров в микроскоп. И, в-третьих, по крайней мере, в наших руках, некоторые цвета производят яркие сигналы более последовательно, чем другие. Мы всегда использовали DAPI (синий) как контрастирующая что делает Alexa Fluor 555 (красный), 488 (зеленый), и 647 (дальнего красного) Хороший выбор для маркировки зондов. С нашей системой визуализации, мы обнаружили, Alexa Fluor 555 (красный) для получения ярких сигналов, а затем Alexa Fluor 488 (зеленый). Alexa Fluor 647 (дальний красный) имеет тот недостаток, что он не может быть обнаружен человеческим глазом, и, следовательно, никакие сигналы не видно если смотреть в микроскоп. Таким образом, если делать двухцветной FISH, мы рекомендуем сочетание красного и зеленого красителей. Две основные проблемы могут возникнуть: клетки смывая горки и слабых сигналов. Насколько хорошо клетки придерживаться слайд чрезвычайно переменной Betwееп типов клеток, и лучший протокол для урегулирования / семян клетки должна быть определена. Мы успешно использовали либо положительно заряженных или поли-L-лизин покрытием слайды (купил готовый к использованию), но обнаружил клетки в целом соблюдается лучше поли-L-лизин покрытием слайды. Мы также обнаружили, что, когда клетки были слишком плотные целые районы будет шелушиться, как лист, в то время как автоматизированные изображений было затруднено, если клетки были слишком редкие. Таким образом, если образец не слишком драгоценно, различных номеров сотовых должны быть посеяны для определения идеальной плотности. Если клетки особенно подвержены смыть, гидрофобный барьер ручка может быть использована, и рыба шаги могут быть выполнены тщательно пипеткой растворы непосредственно на слайде. Пипетирование также резко снижает объемы реактивов, необходимых, но занимает значительно больше времени при выполнении нескольких слайдов. Слабые сигналы, как правило, из-за плохого зондов, и это хорошо стоит инвестировать время в создание хороших. Чистый BAC ДНК следует использоватьг в качестве исходного материала, который можно получить повторным осаждением или коммерчески доступных наборов. Загрязнение бактериальной ДНК геномного негативно сказывается на качестве зонда и бережного обращения во время лизиса клеток и фильтрации клеточного лизата обязан держать его до минимума. Это, однако, нет необходимости использовать экзонуклеазная шаг переварить линейной ДНК, так как это значительно снижает выход. Эффективное метки в образец имеет решающее значение. Самое важное качество управления на данной стадии, проверяя размер фрагмента после ник-трансляцией (см. Представитель Результаты). «Хорошо» мазка почти всегда приводит в ярких зонда. Тем не менее, мы обнаружили, что иногда определенные BAC не могут быть обработаны в хорошем зонда, а другой BAC должен быть выбран. Другим важным шагом является тепловой денатурации. Если температура слишком низка, ДНК будет только частично денатурированный и гибридизации зонда будет нарушена. Если температура слишком высока, ядерной структуры шбудете возмущенных больше, чем необходимо. В наших руках, 78 ° C на перевернутом горячем блоке идеальный компромисс, но это может варьироваться в зависимости от соответствующего блока, используемого горячей. У нас были хорошие результаты, используя Vectashield монтажную среду, но обнаружил, что SlowFade Золото имеет меньше фона и сохраняет флуоресцентный сигнал дольше. Мы не рекомендуем использовать жесткий набор монтажа среды, как мы обнаружили, что это влияет на структуру и 3D, чтобы сформировать пузырьки воздуха с течением времени. В заключение, ярко флуоресцентный непосредственно меченых зондов вместе с протоколом ДНК FISH описанных здесь предлагают эффективное решение для надежного и быстрого анализа ядерных архитектуры, которая применима к широкому разнообразию биологических вопросы.

ДНК флуоресценции в гибридизация (ДНК FISH) позволяет трехмерной визуализации отдельных локусов гена, subchromosomal доменов и даже целые хромосомы на всех стадиях клеточного цикла. 2D FISH используется для исследований, а метафаза 3D рыбу был широко использован для исследования взаимосвязи между пространственной организации генома и его функции во время интерфазы (1,2 и ссылки там). Исторически, со-ассоциации исследования проводились путем изучения десятков до сотен отдельных локусов рыбой. Совсем недавно мощный высокую пропускную способность 3C на основе методов, таких как 4С и Привет-C были разработаны 3, позволяя исследования молекулярных перекрестные помехи между множеством тысячи различных локусах. В то время как 3C методов, основанных на ДНК, и рыба может быть дополнительным методам, они не обязательно отвечать на те же вопросы. 3C основе метода обеспечивают ансамбль считывания смешанной популяции клеток, в результате чего вероятностиности для сотрудничества ассоциаций. В противоположность этому, в то время как низкий по пропускной способности, на основе методов FISH предлагаем возможность анализировать пространственные расположения локусов хромосом или в отдельных камерах, в соответствии с их развитием или ячейки стадиях цикла. Таким образом, рыба продолжает быть важным инструментом для исследования ядерных структурно-функциональных отношений. Есть два основных соображения при проведении успешных экспериментов 3D FISH. Это: 1. получение оптимально меченых зондов и 2. выбор сотовой лечения, включая фиксации, пред-и пост-гибридизации шаги для сохранения морфологии ядра как можно больше, делая ДНК достаточно доступной для гибридизации с зондом. Эффективная маркировка зонда является критически важным для рыб. Традиционно ник-перевод был использован для введения или гаптен или флуорофора конъюгированных нуклеотидов 4. Кроме того, коммерческие ник-трансляции комплекты доступны для прямого или Гаптен флуорофором включения, бут также для двухступенчатого мечение с применением aminoallyl нуклеотидов и амин-реактивных красителей. Последняя оказывает включение красителя более эффективным, давая ДНК-полимераза менее громоздким молекулы работать. Совсем недавно, наборы для неферментативном маркировки ДНК были разработаны, которые эксплуатируют координационного связывания платины с нуклеиновыми кислотами. FISH зондов даже может быть приобретена уже помечены 5. В то время как наборы и серийно выпускаемые зонды Нет сомнения, дают простоту использования, они значительно дороже, чем покупка отдельных компонентов и производства зондов в доме. Мы оптимизировали низкой стоимости ник-трансляции протоколов для того, чтобы непосредственно маркировать различные зонды BAC в нескольких цветах. Мы обнаружили, что получение высокочистого BAC ДНК является критическим и приводит к требованию только 10-20 нг зонд за FISH слайдов, по сравнению с 10 - 20 раз больше, когда ДНК нечистый шаблон используется, что приводит к большой стоимости и времени сбережений. Использование амино-allyldUTP позволяет гибко маркировкиЗонды с имеющимися амина активных красителей (например, Alexa Fluor или Cy-красителей) или гаптенам (например, биотин, дигоксигенина). Гаптен-меченных зондов обнаружено флуорофора конъюгированных антител или стрептавидина для усиления и вывода сигнала. Яркие непосредственно меченых зондов обычно показывают менее фоновое окрашивание и избежать чрезмерного усиления сигналов, следовательно, в результате чего более точное представление о ядерной локализации и локус морфологии. Есть несколько различных методов FISH, которые используют различные фиксаторы, предварительная обработка и пост-гибридизации моет но они обычно подразделяются на следующие категории: глутаральдегиде фиксации NaOH денатурации, формальдегида фиксации HCl денатурации и формальдегид фиксации тепловой денатурации 6-9 . Каждая из них имеет свои преимущества и недостатки. Глутаральдегида фиксации приводит к хорошим ядерный структурный сохранения, но требует лечения восстановителей, чтобы минимизироватьв результате флуоресценции и NaOH лечение необходимо тщательно контролировать, чтобы уравновесить достаточным денатурации ДНК и возможность повреждения структуры ядра 6. Формальдегид фиксации меньше мощное устройство, обеспечивающее повышенную вероятность возмущения ядерной архитектуры, но и обычно дает более сильные и надежные сигналы и нижней аутофлюоресценция 9. HCl лечения depurinates ДНК и удаляет белки, обеспечивая хороший доступ к ДНК для зондов, но могут также ввести разрывов ДНК. Отопление физически разделяет две нити ДНК в результате гибридизации хорошая цель и сильных сигналов, но может вызвать некоторое возмущение структуры ядра 8. Степень, в которой каждый из этих методов влияет белковые эпитопы колеблется в широких пределах 6,9, что приводит к требованию экспериментально определить для каждого белка оптимального протокола для использования в иммуно-FISH экспериментов. В то время как нет «идеальных» ДНК FISH TEchnique, все они могут быть полезны, если хорошо контролируются. Нашей целью было оптимизировать протокол для надежной и воспроизводимой ДНК FISH исследовать пространственное расположение нескольких локусов в различных типах клеток 10, сосредоточив внимание на способ нагрева для самых надежных сигналов. С этим и использования автоматизированной системы визуализации мы, направленные на повышение пропускной способности для одного анализа клетки ядерных договоренностей.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NTB buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>D-1532</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs</td>
 <td>Bioline</td>
 <td>BIO-39025</td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aminoallyl-dUTP</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM8439</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA Polymerase I</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M02095</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase I recombinant RNase free</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4716728001</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR purification kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104</td>
 <td>Step 1.1.4, 1.2.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOAc</td>
 <td>VWR</td>
 <td>27653</td>
 <td>Step 1.1.5, Step 2.1.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S5761</td>
 <td>Step 1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications</td>
 <td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
 <td>A32750, A32756, A32757</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO (anhydrous) </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>276855</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
 <td>Life Technologies </td>
 <td>S33102</td>
 <td>Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cot-1 DNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18440-016</td>
 <td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single stranded DNA from salmon testes </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>D7656 </td>
 <td>Step 2.1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized formamide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-9037</td>
 <td>Step 2.1.1.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate</td>
 <td>Sigma Life Sciences</td>
 <td>D8906 </td>
 <td>Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XMP painting probes</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td>000000-0528-837</td>
 <td>Step 2.1.1.4 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine coated slides</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P0425</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrophobic pen (ImmEdge)</td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>H-4000</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m sieve (Mouse fetal liver cells only)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352350</td>
 <td>Step 2.1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P6148 </td>
 <td>Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Cl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saponin from Quillaja bark</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T9284 </td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Life Technologies (GIBCO)</td>
 <td>70011-036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>G/0650 </td>
 <td>Step 2.1.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20252</td>
 <td>Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47670</td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SSC</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 22</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022022A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 50</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022050A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rubber cement</td>
 <td>Marabu</td>
 <td>2901 (10 000)</td>
 <td>Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen Molecular Probes</td>
 <td>D3571</td>
 <td>Step 2.2.8 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlowFade Gold</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S36936</td>
 <td>Step 2.2.10 (mounting medium)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear nail polish</td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.2.10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nanodrop 2000</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td>
 <td>GE Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coplin jars</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td>
 <td>Step 2.1.3 onwards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen dewar </td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Base with Black Lid (light-tight chamber)</td>
 <td>Simport</td>
 <td>M920-2</td>
 <td>Step 2.1.17</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer comfort</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5355 000.011</td>
 <td>Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 &deg;C room)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Imaging and Image processing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metafer - Imaging Automation Platform</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axio Imager Z2 upright</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>epifluorescence microscope used with automated imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IX81 confocal microscope (FV1000)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>confocal microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bitplane, version 7.3</td>
 <td>Imaris</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and 3D modeling software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scientific volume Imaging, version 4.1</td>
 <td>Huygens</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and deconvolution software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 FISH buffers and reaction mixes 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Composition</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x NTB buffer</td>
 <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.05 M MgCl2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mg/ml BSA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix</td>
 <td>0.5 mM dGTP</td>
 <td>Store 50 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dATP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dCTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.125 mM dTTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 % PFA</td>
 <td>Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 &deg;C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA.</td>
 <td>Store 50 ml aliquots at -20 &deg;C, do not re-freeze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 % saponin solution</td>
 <td>Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. </td>
 <td>Store 5 ml aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 x SSC</td>
 <td>Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate mix</td>
 <td>20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight.</td>
 <td>Store 500 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>

robust 3d dna fish using directly labeled probes

3D FISH ДНК стала одним из основных инструментов для анализа трехмерной организации ядра, и несколько вариаций техники были опубликованы. В этой статье мы опишем протокол, который был оптимизирован для надежности, воспроизводимости и простоте использования. Ярко флуоресцентных меченых зондов непосредственно генерируются ник-трансляции с амино-allyldUTP следуют химическая связь красителя. 3D ДНК FISH выполняется с помощью замораживания-оттаивания шаг для ячейки проницаемости и стадию нагревания для одновременного денатурации зонда и ядерной ДНК. Протокол применим к различным типам клеток и различных датчиков (БАС, плазмиды fosmids или полного краски хромосомы) и обеспечивает высокую пропускную способность автоматизированной обработки изображений. С помощью этого метода мы регулярно рассматривают ядерную локализацию до трех участках хромосом.

Протокол, описанный здесь (рис. 1 для обзора) был использован для большого эффекта объединить ДНК рыбы с высокой пропускной способностью захвата изображения для анализа геномной организации. Поколение хороших зонды качество имеет решающее значение для успеха (см. обсуждение). 2 демонстрирует два важных контролем качества для рыб зондов. После ник-трансляции, мазок из ДНК должна быть видна при этом большая часть фрагментов работает между 150 и 700 п.н. (рис. 2А). После химической связью, включение флуоресцентного красителя можно судить по спектроскопического анализа зонда (фиг. 2В). При использовании хорошо зондов, в соответствии с протоколом ДНК FISH обычно приводит к яркой ДНК FISH сигналов на низкий фон. Мы успешно использовали этот протокол на различные типы клеток, и с любым флуоресценции или конфокальной микроскопии. Автоматизированная визуализации с использованием эпи-fluorescencэлектронной микроскопии требует острый, легко идентифицировать FISH сигналов с небольшой фон (рис. 3), в то время конфокальной микроскопии требует более интенсивных сигналов. рисунке 4а показаны представителя обработанных изображений. Ядерный координаты FISH сигналы могут быть получены, и пространственные соотношения геномных областей могут быть вычислены (в качестве примера см. фиг.4В). Мы также использовали стеки получены с помощью конфокальной микроскопии для 3D моделирования FISH сигналы на их территории хромосомы (Фильм 1). <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Рисунок 1. Последовательность действий для маркировки зондом и ДНК FISH. Зонд подготовки показаны синим цветом. Процедура ДНК FISH показан в черном, с параметрами, указанными в зеленый цвет. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Всегда&quot;&gt; <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Рисунок 2. Маркировка зондов ник-трансляции и контроля качества меченых зондов. ) Гель показывает идеальный мазок перед нагреванием для инактивации ДНКазы I (дорожка 1: лэддер ДНК, полоса 2 и 3: BACs после ник-перевод). Фрагменты должны быть в диапазоне 150-700 б.п.. Дополнительных мазков при ~ 1 кб часто наблюдается с успешными ник-трансляции реакций. B) микрообъема полный анализ спектра меченых зондов. ДНК пик при 260 нм наблюдается со второй пик, соответствующий длине волны поглощения флуорофора зонд помечен: Alexa Fluor 488: 495 нм, Alexa Fluor 555: 555 нм, Alexa Fluor 647: 650 нм. Показаны три зонда с хорошим включение: пики поглощения флуорофора является одинаковой высоты или выше ДНК пиков. Alexa Fluor 647 обычно имеет более высокое поглощениечем Alexa Fluor 555, который, в свою очередь, имеет более высокую, чем поглощение Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 также поглощает свет при 260 нм, следовательно, первый пик для этого зонда выше, чем другие. Зонды с плохим поглощения шоу флуорофором включения 2-в 3 раза ниже, чем поглощение ДНК. Зонды с более, чем в 2 раза выше, чем пик флуорофор ДНК пик обычно содержат неконъюгированный краситель, который может вызвать фона в FISH. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Рисунок 3. Скриншот из MetaCyte 3D FISH ПО для обработки изображений, показывающей типичную трехцветного FISH эксперимента. Экран разделен на несколько частей.) Сырье поля-обзора (FOV) изображение, снятое Metafer / MetaCyte слайд сканирование системы. B) Галерея изображений выявленных ядрышки с ООНпретерпевших обработки изображений и сегментации для рыб сигналов. Различные типы данных могут быть отображены на каждой галереи изображения. В этот номер сотового пример показан верхний левый с различными межаллельной и interlocus расстояния верхнем правом и в обе стороны под каждым изображением.) Вложите имя с числом ядер определена в ходе анализа. D) изображением слайда с областью сканируется системы. Е) Расширение области сканирования. Белые пятна представляют определены ядер в поле зрения. F) обрабатываемых данных. В этом примере максимальный межаллельной расстояния между зеленым сигналов (вверху) и красный сигналы (внизу) показаны. Отображаются данные от мыши P20 половых клеток. Зонды расположены на разных хромосомах, охватывающих Hbb и Hba генов и гистонов кластера. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Внутри-страница = &quot;всегда&quot;&gt; <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Рисунок 4. Примеры обработанных изображений и производных данных о местоположении. А) Обработанные изображения для E13.5 мыши клетки печени эмбриона окрашивали зондов BAC расположены на разных хромосомах покрытие Myc и Kcnq1 генов (называемых Myc и KvDMR, цветной зеленый и красный, соответственно). B) Тьюки коробчатого усами представляющая межаллельной расстояние Распределение по той же локусов в 600 ядер. Межаллельной расстояние нанесена в виде доли от радиуса ядра (расстояние / радиус) для учета изменений размера ядра. Ядер ЭС клеток иметь радиус около 5 мкм. Красный зондов значительно ближе друг к другу, чем зеленый зондов (***: р &lt;0,01, непарного т-теста). Данные от 10. Фильм 1. 3D моделирование двух локусов хромосомы в пределах их тerritory. Два BAC зондов, расположенных близко к любому концу хромосоме 7 мыши были помечены (красного и дальнего красного, (псевдо-белого цвета)) и гибридизовали вместе с целой хромосомы краски (зеленый), чтобы ЭС клеток мыши. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes at JoVE.com

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Мы описываем надежный и универсальный протокол для анализа ядерной архитектуры 3D рыбу непосредственно ДНК с использованием меченых флуоресцентными зондами.

Прочная 3D рыбу ДНК с использованием меченых зондов непосредственно

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Прямое наблюдение Ферменты Репликация ДНК Использование одиночных молекул ДНК Растяжка Пробирной

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

ДНК-идентификация видов рыб протокола

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Комбинированные иммунофлуоресценции и ДНК рыб на 3D-сохранена интерфазных ядер для изучения изменений в 3D-ядерный организации

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация (FISH) по изучению Х-хромосома инактивации в Дифференцированный Женский эмбриональных стволовых клеток мыши

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Синтез Длина волны сдвига ДНК гибридизационных зондов с помощью фотостабильным цианиновыми Красители

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Наблюдение и Количественная теломер и повторяющихся последовательностей с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация (FISH) с зондами PNA<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Рыбы спермы оценки с использованием программного обеспечения и охлаждающих устройств

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...