Name: genetically-encoded molecular probes to study g protein-coupled receptors
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Biz birkaç vakıf ve hayırsever bağışçıların cömert desteği (SakmarLab.org bakınız) teşekkür ederim.

1.. GPCRs içine Doğal olmayan amino asitlerin bölge spesifik genetik Incorporation <ol><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T hücreler (glukoz 4.5 g / L, 2 mM glutamin) koruyun. </li><li> Lipofektamin Plus tepkin maddesi kullanılarak 10 cm&#39;lik bir plaka içerisinde% 60-80 konflüansa büyütülmüştür hücreleri transfekte. <ol><li> 750 ul DMEM için, arzu edilen bir pozisyonda amber durdurma kodonu ihtiva eden 10 ul Plus...

<ol>
	<li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors:+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery.">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li><li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states.">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists.">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+eukaryotic+genetic+code.">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis.">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li><li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes.">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes.">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li><li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin.">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li><li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal.">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li><li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes.">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li><li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal.">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li><li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5.">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li><li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li><li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli.">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li><li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid.">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li><li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+(GPCR)+using+genetically+encoded+photocrosslinkers.">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li><li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor.">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li><li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy.">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li><li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies:+application+to+GPCR+oligomerization.">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li><li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escaping+the+flatlands:+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes.">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction.">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li><li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation.">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strain-promoted+[3+++2]+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems.">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li><li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery.">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li><li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin:+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure.">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+&#197;+crystal+structure.">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 &#197; crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li><li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups.">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , (2013).</li><li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid.">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin:+characterization,+cross-reactivity,+and+application+as+structural+probes.">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li><li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor.">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li><li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+structure,+dynamics,+and+activation:+A+perspective+from+crystallography,+site-directed+spin+labeling,+sulfhydryl+reactivity,+and+disulfide+cross-linking.">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li><li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking:+use+of+a+photoactivatable+reagent.">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzophenone+photophores+in+biochemistry.">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation.">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li><li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl)+lysine+for+site-specific+protein+modification.">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry &amp; biology. 15, 1187-1197 (2008).</li></ol>

Biz GPCRs içine, reaktif bir prob, AZF site-spesifik birleşme için buraya sağlam bir metodoloji tarif ve GPCRs yapısını ve dinamiklerini incelemek için bu aracı üç yararlı uygulamaları göstermek. Bizim yöntem sitede-özellikle UAA&#39;lar kimyasal 32, 33 etiketleme veya tek erişilebilir sistein mutant foto 34 bağlama dayalı alternatif bir strateji ile temel bir problemi aşılmaktadır dahil. Sistein tiyol grupları hedef kimyaları flüoresan millerini takmak için kullanılmış...

Heptahelikal G-protein bağlı reseptörler (GPCR&#39;ler) önemli ve çeşitli hücre-dışı sinyallerin aracılık eden yüksek dinamik zar proteinlerinin bir üst ailesidir içermektedir. Klasik paradigmada, reseptör aktivasyonu ligand bağlı şekilsel değişiklikleri ile birleştirilmiştir. 1 GPCRs yapısal biyoloji 2 Son gelişmeler zar sinyalizasyon moleküler mekanizmaları üzerinde önemli fikir vermiştir. 3-5 Ancak, daha büyük kimyasal hassasiyet ile anlamak için fonksiyonel mekanizma ve GPCR&#39;dir sinyal yapısal dinamikleri, yaklaşımları bir araç aktif bir sinyal kompleksleri sorgulamak için bilgilendirici moleküler ve kimyasal sondalar dahil etmek gereklidir. Bu amaçla, site-spesifik olarak, daha önce Schultz ve c öncülük bastırma teknolojisi kullanılarak amber kodonu doğal olmayan amino asit (UAA) mutagenez göre ifade edilen reseptörlerine olmayan veya minimal bozucu probları tanıtmak için bir yöntem adapteoworkers. 6 Bu örneğin memeli hücreleri dışındaki çok heterolog ifade sistemlerinin zordur GPCRs gibi proteinler için yüksek verim ekspresyonu ve mutagenez sistem elde etmek için UAA mutagenez yöntemi optimize edilmiştir. Ortogonal bir mühendislik bastırma tRNA kullanarak ve belirli bir UAA için aminoasil-tRNA sentetaz çifti gelişti, site-spesifik ifade hedef GPCRs içinde UAA&#39;lar tanıttı. UAAS başarıyla dahil edilmesi, p-asetil-L-fenilalanin (ACF), p-benzoil-L-fenilalanin (BZF) ve p-azido-L-fenilalanin (azf) bizim modeli GPCRs olarak gösterilmiştir - rodopsin ve insan CC kemokin alıcısı, CCR5. 7, 8 Prensip olarak, bir UAA genetik olarak protein dizisi içinde herhangi bir pozisyonda kodlanabilir ve bir hedef GPCR tek kodon tarama olanak olarak bu özelliği bir değerli biyokimyasal bir araçtır. Biz bir reaktif Azi olan UAA, azf, çok yönlülük, özellikle burada odakparçasını yapmak. 9 AZF aynı zamanda komşu birincil aminler ya da alifatik hidrojenlerin ile reaksiyona sokularak bir ışıkla çapraz bağlayıcı olarak hizmet edebilir, bir kızıl ötesi (IR) probu, 8, olarak hizmet ek olarak. Buna ek olarak, biyolojik açıdan atıl azido grubu bioorthogonal etiketleme reaksiyonlarda bir seçici kimyasal tutma yeri olarak katılabilir. İşte biz böyle tuzak hedefli foto çapraz bir reseptör-ligand kompleksi ve bioorthogonal epitop etiketleme ve floresan etiketleme stratejilerinin GPCRs modifikasyonu gibi GPCRs, içine AZF site-spesifik esas yararlı uygulamaları gösteren örnekler sunuyoruz. Işıkla aktive reaktifler 1960&#39;lardan beri biyolojik sistemler incelemek için kullanılmıştır. Bu dönemde 10, reseptör-ligand çapraz bağlama deneylerinin bir bolluk GPCR kompleksleri incelemek için rapor edilmiştir, burada en fotoafinite ligandları kullanımını içeriyordu. 11, 12 Bununla birlikte, bu Onlar gerektirmeyen gibi uygulamalar teknik, sınırlıBir çapraz bağlama grubu taşıyan ligandların e sentezi. 13-15 Ayrıca, liganddaki çapraz bağlayıcı parça ile, bu GPCR&#39;nin üzerinde çapraz link yerini belirlemek zordur. Site özel bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı proteinlere UAAS olarak foto-çapraz grupların dahil değerli bir gelişmedir. 16, 17 Biz, bir reseptör-ligand kompleksinin oluşmasına katılan bir reseptör üzerinde bağlayıcı arayüzü tanımlamak için bir foto-çapraz bağlı bir teknik geliştirdi GPCRs içine fotolabil gruplar getirerek hücreleri canlı. 18, 19 Burada, bir küçük moleküllü ligand bağlama sahası, CCR5 üzerinde tritiye Maraviroc tanımlamak için bu hedef foto-çapraz teknolojiyi uygulamak için, deney protokolü ve veri analizi yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem, doğal ligandın kimyasal yapısını koruyarak ek olarak, ligand üzerindeki radyoaktif kolu, kesin miktar istifade eder. Floresans-tabanlı teknikler, doğrudan reseptörünün oluşum durumunu tarama ile reseptör aktivasyonunun yapısal temeli tam görüşü destekler. 20, 21 Bununla birlikte, GPCRs flüoresan etiketler tanıtmak için esneklik sahip teknikler site-spesifik olarak sınırlı bulunmaktadır. Biz GPCR sinyalizasyon komplekslerin tek-molekül algılama (SMD) kolaylaştırmak için bioorthogonal kimyasal modifikasyon stratejileri istihdam ilgilendi. 22. Azido grubu, Stadinger-Bertozzi ligasyon, 23, 24 bakır-germeli terfi azid-olarak bioorthogonal kimyaları katılabilir alkin siklo-(SpAAC) 25 ve bakır ile katalize edilen azit-alkin siklo (CuAAC). 26 İletişim bir azid ve bir fosfin arasındaki özel reaksiyon içerir Staudinger Bertozzi-bağlama reaksiyonu, burada odaklanır. Bir peptid epitop (FLAG peptidi) veya bir fluoresan bir etiket maddeye konjüge iki farklı fosfin türevlerinin kullanımını göstermektedirGPCRs siteye özgü modifikasyonu elde etmek için (fluorescein). Biz daha önce maruz çözücüdür hedef siteleri seçmek için X-ışını kristal yapıya ve dinamik simülasyonları kullanarak azf varyantları rodopsin site-spesifik etiketleme koşullarını optimize edilmiş. 27., 28. Biz de by background-serbest etiketleme ulaşmak için fizibilite resimli Staudinger- Bertozzi ligasyon. 29 İletişim burada immün afinite matrisi üzerinde hareketsiz hale getirildi ve daha sonra in-jel floresan ile görselleştirilmiştir bir deterjan-çözünebilir reseptörünün floresan etiketleme elde etmek için kullanılan genel prosedürü göstermektedir. Ayrıca, bilinmeyen yapı, CCR5&#39;in bir reseptör üzerinde etiketleme için uygun pozisyonları belirlemek için bu etiketleme strateji üzerinde yararlı bir uzantısı göstermektedir. Bu AZF-GPCR, hücre bazlı bir yarı yüksek bir ürün formatında varyantları bioorthogonal modifikasyonu dayanır bir hedef peptid epitop etiketleme stratejisi kullanılarak gerçekleştirilir. 30 Buyöntem etiketleme olayları izlemek için bir hücre-yüzey ELISA çok adımlı algılama özelliklerini kullanır. Biz burada tartışmak metodolojiler genel ve ilkesel olarak bastırma teknolojisi kodon sarı kullanarak azf ile dahil herhangi GPCR&#39;nin uygulanabilir. Ayrıntılarıyla GPCRs yapısal ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi ve bunların daha sonraki uygulamaları kullanılarak bu azf gibi UAAS ile dahil reseptörlerin Memeli hücre ekspresyonunda söz konusu olan adımlar Burada yer alan protokollerde.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pSVB. Yam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pcDNA.RS for azF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2009)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Plus</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine: 18324-012 
			Plus: 11514-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>6162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima ML-3500S UV-A lamp</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>azF is activated by 365-nm light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3117405001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium-labeled ligand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From collaborator (Grunbeck et al., 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD apparatus</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Apparatus for semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powered milk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9934262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint A</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-273</td>
			<td>Scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>333726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Beta-Scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin 1D4 mAb</td>
			<td>National Cell Culture Center</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyblot CL AR film</td>
			<td>Denville</td>
			<td>E3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Targeted photocrosslinking materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-triarylphosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GPHOS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CCR5 2D7 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3601</td>
			<td>Clear bottom, high binding EIA/RIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>DE Healthcare Products</td>
			<td>97-93399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Perseptive Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-phosphine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Huber et al., submitted 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonapeptide (C9 peptide)</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>62190</td>
			<td>Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Scanner with 488-nm wavelength laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Fluorescent labeling materials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetically-encoded molecular probes to study g protein-coupled receptors

Kompleksler sinyal G protein-eşli reseptör (GPCR) yapı ve dinamik çalışma kolaylaştırmak için, yeni yaklaşımlar reseptör fonksiyonunu bozmayan ifade edilen reseptörlerine bilgi sondaları veya etiket tanıtmak için gereklidir. Bu genetik olarak kodlamak için amber kodonunun bastırılması teknolojisi kullanılan doğal olmayan bir amino asit, heterolog memeli hücrelerinde ifade GPCRs çeşitli hedef konumlarda p-azido-L-fenilalanin (azf). Azido grubunun çok yönlülüğü kendi doğal hücre ortamında veya deterjan çözündürülmüş koşullar altında GPCR&#39;ler çalışma için farklı uygulamalar burada gösterilmektedir. İlk olarak, bir trityum etiketli küçük moleküllü ligand genetik olarak kodlanmış bir azido amino asit çapraz bağlı bir GPCR olan ligand bağlama cebinde kalıntılarını belirlemek için hücre bazlı bir foto-çapraz hedeflenen teknoloji göstermektedir. Daha sonra bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligasyon mina ile reaksiyona göre GPCRs siteye özgü modifikasyonunu göstermekfosfin türevleri kullanılarak azido grubunu hedef tion. Biz, bir bütün hücre bazlı bir ELISA yaklaşım kullanarak in-kültür ve algılama ifade zar proteinlerinin hedef peptide epitop etiketleme için genel bir strateji tartışılmıştır. Son olarak, AZF-GPCR&#39;ler seçici floresan probları ile etiketlendi edilebileceğini göstermektedir. Ilke olarak aktif bir sinyal kompleksi sorgulamak için GPCR ifade edilen herhangi bir amino asit pozisyonunda uygulanabilir olduğu tartışılan yöntemler, geneldir.

Bu spesifik yerinde bastırma teknolojisi kodonu kullanılarak sarı renkte bir GPCR olarak molekül probları tanıtmak için doğal olmayan bir amino asit mutagenez yöntemi kullanılabilir. Şekil 1&#39;de şema metodoloji belirgin adımlar ve GPCRs içine, çok yönlü, UAA, p-azido-L-fenilalanin (azf) içeren çeşitli uygulamalarını açıklar. Memeli hücrelerinde AZF-GPCRs sentezlenmesi ligandlarına foto-çapraz hedefli ve bioorthogonal etiketleme kimyasalları ile peptid epi...

Watch this Scientific Journal Video about Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

G Protein-Coupled reseptörleri Agonist Aktivitesi miktarının

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Topraksız: A yönlü Sistemi Toksik Elements Besin Uygunluk ve Pozlama Besin Tahsis ve Bitki Cevapları Eğitim için

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...