Name: isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Bu çalışma JY Sağlık Hibe 5KO8DK085136-02 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1.. Kolon Doku elde Fare Mantığını ve araştırma hedefleri detaylandıran, hayvan deneyleri gerçekleştirmek için bir protokol, teslim ve Hayvancılık Araştırma Gözetim bizim kurumsal Dairesi tarafından onaylandı. <ol><li> Servikal dislokasyon inhale izofluran ile fare Euthanize. </li><li> Ventral orta hat kesi yapmak, uzakta küçük bağırsak geri çekin ve kolon tanımlamak. Yanal mesane ve rahim (varsa) geri çekin ve kasık kemiği belirlemek ve...

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

Fare ya da insan kolon kullanarak zaman genel teknik benzer. Bu teknik aynı zamanda ince bağırsaktan miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. 1 ila miyofibroblastlar izolasyonu için özel bilgiler. Fare ve 2. insan kolon aşağıda tartışılmaktadır. 1.. Fare Kolon Fare kolon sulama kolonun bir ucuna 16 G Popper küt uç iğne, bir 4 takılarak kolaylaştırılır. Uzunlamasına kolon kesim bu da yardımcı olur. Sen iğne üzerine kolon doku Akor...

Gastrointestinal (Gİ) sistem fonksiyonunun düzenlenmesi mukoza tabakası ve onun altında yatan mezenşimin arasındaki karmaşık, dinamik etkileşimleri içerir. Bu etkileşimler, normal dengesini korumak için hizmet değil, aynı zamanda patolojik koşullar altında 1 hastalık durumlarının gelişmesine yol açabilir. Miyofibroblastlar mukozal rejenerasyon, onarım ve fibrozis 2 içeren kritik Gİ süreçlerin bir dizi düzenleyen hücre subpopülasyonunun ülkelerle birlikte bir parakrin iletişim epitel tabakası alttaki bulunan stromal hücrelerin bir alt vardır. İn situ miyofibroblastlar primer özelliklerinin çok paylaştığı için 18Co hücre hattı yaygın olarak miyofibroblast fonksiyonu çalışma için kullanılmıştır, insan kolon miyofibroblast hücre hattının bir örneğidir. Bunlar protein a-düz kas aktin ekspresyonu (α-SMA) ve vimentin yanı sıra, bir dizi ekspresyonunu içerirörneğin, epidermal büyüme faktörü reseptörü, ya da lizofosfatidik asit, 3,4 için reseptör olarak, hücre yüzeyi reseptörlerinin. Çünkü bu ortak ince yapı özellikleri, hem de biyolojik işlevi 5 benzerlikler, 18Co hücre hattı, enflamatuar barsak hastalığı veya kolorektal kanser 3,6 gibi birçok hastalık durumlarının bağlamında miyofibroblast fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, hücre satırını kullanarak doğal sınırlamalar ve endişeler vardır. Bu büyüme oranları ve diğer hücre popülasyonları ile etkileşimler de dahil olmak üzere hücrenin fenotipini ve biyolojik işlevi değiştirerek, primer hücrelerden hücre çizgileri ayıran zamanla genotipik instabilitedir. Hücre hatları, aynı zamanda kullanımı için önemli bir sınırlamadır GI mikro-(epitel, stromal ve vasküler bileşenlerinin), normal bileşenleri eksikliği. Bu nedenle, deneysel hücre çizgisi araştırmadan çıkan sonuçlar ri azaltmak için daha fazla doğrulama gerektirirmisinterpretation sk. Birincil miyofibroblastlar bir hücre hattı 7 belirlenen deneysel bulguları teyit etmek için, insan ve fare kolon dokusundan elde edilebilir. Yöntem ilk Mahida, et al. 8 tarafından tarif edilen, ve protokol, fare ve insan kolon 9 birincil miyofibroblastlar izole etmek için de kullanılabilir, çok iyi tarif edilen tekniklerden biridir. Bağırsak hastalığının herhangi bir fare modeli için, bu teknik, bunlar komşu hücreler ile etkileşime nasıl çalışma veya normal ya da patolojik GI 10,11 süreçleri iki katkı birincil miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. Bu teknik miyofibroblastlar şifa, fibrozis, ve kolorektal adenom ve karsinom gelişimine mukozal nasıl katkıda incelemek için kullanılabilir. Birincil miyofibroblastlar da benign (iltihaplı bağırsak hastalığı, striktür, divertikülit) ya da kötü huylu c operasyon zamanında rezeke edilmiş insan kolon dokusundan elde edilebilirşartlarından. İnsan ve fare kolon dokusundan izole edilmiş primer hücrelerde hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

Miyofibroblast çok GI fonksiyonları kritik rolü için önemli bir önem kazanmaktadır mide-bağırsak (GI) sistemi içinde bir stromal hücresidir. Birkaç miyofibroblast hücre çizgileri bu hücrelerin in vitro çalışma için ticari olarak mevcut olmakla birlikte, deneysel hücre kültür koşullarına maruz bırakılan bir hücre hattından araştırma sonuçları işin aşırı indirgemeci doğası gereği doğal sınırlamaları vardır. Birincil miyofibroblastlann bir hücre çizgisinde tespit deneysel bulguları teyit açısından büyük bir avantaj sunmaktadır. Bir hayvan modelinde birincil miyofibroblastlar izolasyonu daha yakından hastalık durumu çalışılmaktadır taklit eden şartlar altında miyofibroblastlar çalışma sağlar. Hücreler altta yatan hastalığı olan hastalarda doğrudan gelir beri insan kolon dokusundan birincil miyofibroblastlar izolasyonu, tartışmasız en uygun deneysel verileri sağlar. Biz u olabilir köklü bir tekniği açıklarFare ve insan kolon dokusunun hem birincil miyofibroblastlar izole etmek tilized. Bu izole edilmiş hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif ve desmin-negatif olmak karakterize edilmiştir. Birincil miyofibroblast hücreler hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda fazla deneysel amaçlar için kullanılabilir.

Bir kez izole edilmiş, birincil insan miyofibroblastlar hücre kültürü içinde yetiştirilen ve (geçit 4 kadar) geçişlerinin sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir. Bu hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar 5,7 ile tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif olarak karakterize edilir ve desmin-negatif (Şekil 1A) vardır. Ayrıca, tipik bir yıldız şeklinde bir morfoloji (Şekil 1 B) vardır. Birincil miyofibroblastlar daha sonra bir hücre çiz...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Biyoloji

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...