Name: isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure at JoVE.com

עבודה זו התאפשרה הודות לקרן הרקמה האנושית וחקר תא, מה שהופך את הרקמות אנושיות זמינות למחקר. תמיכה כספית עבור עבודה זו קיבלה מהמשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (שם מענק: כבד רשת וירטואלית, מספר מענק: 0,315,759) וHepacult GmbH. תודתנו גם ללכת לעוזרים הטכניים מבנק רקמות Grosshadern בית החולים לאיסוף הדגימות הכבד והעוזרים הטכניים ממתקן Core בידוד תא לביצוע זלוף הכבד ובידוד הפטוציט. בפרט, אנו רוצים להודות לNatalja Löwen עבור הוכחת בהליך זה בווידאו. לבסוף, ברצוננו להודות לNatalja Löwen וEdeltraud Hanesch ליצירת האיורים לאיור 1 ודמויות בסקירה סכמטית של הווידאו.

1. הכנה של פתרונות זלוף ובידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות דרושים לטפטוף של חתיכת הכבד והבידוד של hepatocytes לפי טבלת 1. ניתן לאחסן את פתרונות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון סטרילי כל הפתרונות באמ...

<ol>
	<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Schneider, W. C., Potter, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assay+of+animal+tissues+for+respiratory+enzymes+II.+Succinic+dehydrogenase+and+cytochrome+oxidase.">The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).</li><li>Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+Binucleate+Cell+Counts+in+Resting+and+Regenerating+Rat+Liver+Employing+a+Mechanical+Method+for+the+Separation+of+Liver+Cells.">A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells.</a> Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).</li><li>Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mass+Isolation+of+Whole+Cells+from+Rat+Liver.">The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver.</a> Science. 117, 627-628 (1953).</li><li>Jacob, S. T., Bhargava, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Method+for+Preparation+of+Liver+Cell+Suspensions.">New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions.</a> Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).</li><li>Berry, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Properties+of+Cells+Isolated+from+Adult+Mouse+Liver.">Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver.</a> Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).</li><li>Laws, J. O., Stickland, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+Isolated+Liver+Cells.">Metabolism of Isolated Liver Cells.</a> Nature. 178, 309-310 (1038).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Rat-Liver+Cells+.3.+Enzymatic+Requirements+for+Tissue+Dispersion.">Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion.</a> Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).</li><li>Thasler, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charitable+State-Controlled+Foundation+Human+Tissue+and+Cell+Research:+Ethic+and+Legal+Aspects+in+the+Supply+of+Surgically+Removed+Human+Tissue+For+Research+in+the+Academic+and+Commercial+Sector+in+Germany.">Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany.</a> Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).</li><li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver.">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Pure+Hepatocytes+and+Reticuloendothelial+Cells+in+High-Yield+from+a+Single-Rat+Liver+by+Means+of+Percoll+Centrifugation+and+Selective+Adherence.">Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence.</a> J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).</li><li>Cantrell, E., Bresnick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzpyrene+Hydroxylase-Activity+in+Isolated+Parenchymal+and+Nonparenchymal+Cells+of+Rat-Liver.">Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver.</a> Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).</li><li>Weiskirchen, R., Gressner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of hepatic stellate cells.</a> Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatotic+versus+cirrhotic+livers+as+a+source+for+human+hepatocyte+isolation.">Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation.</a> Transplant P. 33, 664-665 (2001).</li><li>Renz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+extended+donor+criteria+liver+allografts+maximizes+donor+use+and+patient+access+to+liver+transplantation.">Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation.</a> Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).</li><li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+donor+criteria+have+no+negative+impact+on+early+outcome+after+liver+transplantation:+a+single-center+multivariate+analysis.">Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis.</a> Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).</li><li>Alexandre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pre-,+intra-+and+post-operative+parameters+of+donor+liver+on+the+outcome+of+isolated+human+hepatocytes.">Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+review:+Hemostats,+sealants,+and+adhesives+II:+Update+as+well+as+how+and+when+to+use+the+components+of+the+surgical+toolbox.">State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox.</a> Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostats,+sealants,+and+adhesives+III:+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox.">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li><li>Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotoxicity+of+cyanoacrylate+tissue+adhesives.+A+comparative+study.">Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study.</a> Archives of otolaryngology--head &amp; neck surgery. 116, 546-550 (1990).</li><li>Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histotoxicity+of+cyanoacrylates.+A+selective+review.">The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review.</a> Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).</li><li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue:+a+one+hundred+liver+experience.">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222 (2011).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li><li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices.">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The principles of humane experimental technique. , (1959).</li></ol>

פרוטוקול זה גורם לבידוד של hepatocytes האנושי עם כדאיות גבוהה ובטהרה. על מנת להשיג את התוצאות הללו, חשוב להתחיל עם חתיכת הכבד מתאימה. חתיכת הכבד צריכה הכמוסה של Glisson שלמות על כל המשטחים, פרט למשטח לחתוך 1. גורם חשוב נוסף הוא אצווה המסוים של collagenase משמש, כפי שקבוצות שונות יכולו...

השעיה תא כבד ניתן להכין מהכבד בשיטות מכאניות או אנזימטי. שיטות מכאניות המשמשות להכנת תאי כבד שלמים כוללות כפייה של כבד דרך הגזה 2, רועד חתיכת כבד עם חרוזי זכוכית שייקרה קאהן 3, באמצעות homogenizers זכוכית עם עלי רופף 4,5 וכו &#39;במהלך השנים, שיטות מכאניות נפלו מתוך להעדיף בשל הנזק לקרומי תאים ואובדן התפקוד של הפטוציטים המבודדים 6,7. כתוצאה מכך, השימוש בשיטה אנזימטית הוא כיום השיטה העיקרית לבידודה של הפטוציטים. בידוד של hepatocytes באמצעות שיטה האנזימטית השתפר מאוד כאשר ברי והחבר 8 perfused collagenase וhyaluronidase דרך כבד דרך וריד הפורטל בחולדות. תהליך זה מנוצל זלוף כלי הדם כדי לאפשר לאנזימים לבוא במגע קרוב עם רוב של התאים, מה שמוביל לעלייה של פי 6 בתשואה של hepatocytes 8. יתר על כן, שיטה זו הניבה תאים ששמרו על השלמות המבנית שלהם, עם כמעט ללא שינוי של reticulum endoplasmic לתוך שלפוחית ​​מבודדת ולא נגרם נזק המיטוכונדריה 8. שיטה זו שונה על ידי 1 Seglen, שהיה חלוץ הליך זלוף שני שלבים לבידוד בתאים כבד. בהליך זה, בכבד חולדת perfused עם 2 + חיץ חופשי Ca אחרי זלוף עם חיץ collagenase המכיל Ca 2 + 1. ההסרה של Ca 2 + בשלב הראשון מסייעת לשבש דסמוזומים, תוך התוספת של Ca 2 + בשלב השני נדרשת לפעילות collagenase אופטימלית 1,9. בהתחשב בכך שהעבודה שפורסמה שתוארה לעיל בוצעה בחולדות, מאמר זה נועד להדגים הליך שונה שיכול לשמש לבידודה של הפטוציטים עם כדאיות גבוהה מזמזוםכבדים. השימוש בhepatocytes האנושי נשאר חשוב למחקר translational ולאימות ניסויים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים. חתיכות הכבד האנושיות השתמשו במחקר זה נרכשו בהסכמה לממשל דרך הקרן לחקר רקמות ותאים אנושיים, קרן ללא כוונת רווח בשליטה ממשלתית 10. לאחר הפתולוג הסיר את מה שנדרש לאבחון, חתיכות כבד נאספו מהרקמות שנותרו. הרקמה מחולק על ידי פתולוג הייתה מורפולוגית רקמה בריאה המתקבלת משולי כריתה לאחר כריתת כבד.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass jacketed condenser</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 &deg;C Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>35723-H24/EG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &deg;C Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)</td>
			<td>Linde</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas permeable tubing</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>2-4440</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>IP65</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>320010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5171014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 1 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 5 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121673</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2110654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352075</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5144063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved irrigation cannulae with ball tips</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vascular clamps</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HT38.1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 210 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 70 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1419</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m sterile filters</td>
			<td>Peske</td>
			<td>99505</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180154</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Peske</td>
			<td>06-0001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120,086</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>1508454</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Pasteur pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorised pipette filler (Pipette boy acu)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Hera safe-KS9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator (Low-flow surgical suction pump)</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>C361</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Gas Burner</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Fire Boy eco</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable laboratory coat</td>
			<td>Paperlynen GmbH</td>
			<td>MD0202414</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical mask with visor</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>48247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical hood</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>42072</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Semper Care</td>
			<td>CE0321</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Batch number NB 4G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>17465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26868</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>01400-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Serva</td>
			<td>22700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>30180</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold storage solution</td>
			<td>Hepacult GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure

הכבד, איבר עם יכולת התחדשות יוצאת דופן, מבצע מגוון רחב של פונקציות, כגון סילוק רעלים, חילוף חומרים ועל הומאוסטזיס. ככזה, hepatocytes הוא מודל חשוב למגוון רחב של שאלות מחקר. בפרט, השימוש בhepatocytes האנושי הוא חשוב במיוחד בתחומי פרמקוקינטיקה, טוקסיקולוגיה, התחדשות כבד ומחקר translational. לכן, שיטה זו מציגה גרסה שונה של הליך זלוף collagenase שני שלבים לבודד hepatocytes כפי שתואר על ידי 1 Seglen. בעבר, hepatocytes היה מבודד בשיטות מכאניות. עם זאת, שיטות אנזימטיות הוכחו להיות מעולה כמו hepatocytes לשמור על השלמות המבנית שלהם ותפקוד לאחר בידוד. שיטה זו המוצגת כאן מתאים את עצמו בשיטה שנועדה בעבר לכבדי חולדה לחתיכות כבד אנושיות ותוצאות בתשואה גדולה של הפטוציטים עם כדאיות של 77 10% ±. העיקריהבדל בהליך זה הוא התהליך של cannulization של כלי הדם. יתר על כן, בשיטה שתוארה כאן יכולה להיות מיושמת גם לכבדים ממינים אחרים עם גדלים בכבד או בכלי דם דומים.

התקנת זלוף הציוד הדרוש לזלוף כבד יש להגדיר על פי איור 1. כדאיות ותשואה של hepatocytes אדם מבודד הכדאיות הממוצעת של hepatocytes אדם הבודד הייתה 77 ± 10% והתשואה המ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure at JoVE.com

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...