Name: isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00
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Este trabalho foi possível graças a Fundação de Pesquisa de células e tecidos humanos, o que torna tecidos humanos disponíveis para a pesquisa. O apoio financeiro para este trabalho foi recebido do Ministério Federal de Educação e Pesquisa (nome concessão: Fígado de Rede Virtual, número de concessão: 0315759) e Hepacult GmbH. Nossos agradecimentos vão também para os assistentes técnicos do Banco de tecidos Grosshadern Hospital para a recolha das amostras do fígado e dos assistentes técnicos do Núcleo instalação de isolamento celular para a realização da perfusão hepática e isolamento dos hepatócitos. Em particular, gostaríamos de agradecer Natalja Löwen para demonstrar este procedimento no vídeo. Finalmente, gostaríamos de agradecer Natalja Löwen e Edeltraud Hanesch para criar as ilustrações para a Figura 1 e as figuras na visão esquemática do vídeo.

1. Preparação da perfusão e isolamento Solutions <ol><li> Preparar as soluções necessárias para a perfusão do pedaço de fígado e o isolamento de hepatócitos de acordo com a Tabela 1. As soluções podem ser armazenadas a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Filtrar em condições estéreis todas as soluções que utilizam um filtro de 0,22 um. </li><li> Todas as soluções que entram em contato com o fígado deve ser estéril. </li></ol> 2. Preparação de Perfus?...

<ol>
	<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Schneider, W. C., Potter, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assay+of+animal+tissues+for+respiratory+enzymes+II.+Succinic+dehydrogenase+and+cytochrome+oxidase.">The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).</li><li>Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+Binucleate+Cell+Counts+in+Resting+and+Regenerating+Rat+Liver+Employing+a+Mechanical+Method+for+the+Separation+of+Liver+Cells.">A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells.</a> Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).</li><li>Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mass+Isolation+of+Whole+Cells+from+Rat+Liver.">The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver.</a> Science. 117, 627-628 (1953).</li><li>Jacob, S. T., Bhargava, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Method+for+Preparation+of+Liver+Cell+Suspensions.">New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions.</a> Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).</li><li>Berry, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Properties+of+Cells+Isolated+from+Adult+Mouse+Liver.">Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver.</a> Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).</li><li>Laws, J. O., Stickland, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+Isolated+Liver+Cells.">Metabolism of Isolated Liver Cells.</a> Nature. 178, 309-310 (1038).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Rat-Liver+Cells+.3.+Enzymatic+Requirements+for+Tissue+Dispersion.">Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion.</a> Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).</li><li>Thasler, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charitable+State-Controlled+Foundation+Human+Tissue+and+Cell+Research:+Ethic+and+Legal+Aspects+in+the+Supply+of+Surgically+Removed+Human+Tissue+For+Research+in+the+Academic+and+Commercial+Sector+in+Germany.">Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany.</a> Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).</li><li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. 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Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).</li><li>Cantrell, E., Bresnick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzpyrene+Hydroxylase-Activity+in+Isolated+Parenchymal+and+Nonparenchymal+Cells+of+Rat-Liver.">Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver.</a> Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).</li><li>Weiskirchen, R., Gressner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of hepatic stellate cells.</a> Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatotic+versus+cirrhotic+livers+as+a+source+for+human+hepatocyte+isolation.">Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation.</a> Transplant P. 33, 664-665 (2001).</li><li>Renz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+extended+donor+criteria+liver+allografts+maximizes+donor+use+and+patient+access+to+liver+transplantation.">Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation.</a> Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).</li><li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+donor+criteria+have+no+negative+impact+on+early+outcome+after+liver+transplantation:+a+single-center+multivariate+analysis.">Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis.</a> Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).</li><li>Alexandre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pre-,+intra-+and+post-operative+parameters+of+donor+liver+on+the+outcome+of+isolated+human+hepatocytes.">Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+review:+Hemostats,+sealants,+and+adhesives+II:+Update+as+well+as+how+and+when+to+use+the+components+of+the+surgical+toolbox.">State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox.</a> Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostats,+sealants,+and+adhesives+III:+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox.">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li><li>Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotoxicity+of+cyanoacrylate+tissue+adhesives.+A+comparative+study.">Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study.</a> Archives of otolaryngology--head &amp; neck surgery. 116, 546-550 (1990).</li><li>Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histotoxicity+of+cyanoacrylates.+A+selective+review.">The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review.</a> Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).</li><li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue:+a+one+hundred+liver+experience.">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222 (2011).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li><li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices.">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The principles of humane experimental technique. , (1959).</li></ol>

Este protocolo resulta no isolamento de hepatócitos humanos com alta viabilidade e pureza. Para atingir estes resultados, é importante para começar com um pedaço de fígado adequado. O pedaço de fígado deve ter cápsula intacta de Glisson em todas as superfícies, exceto para 1 superfície de corte. Outro fator importante é o lote especial de colagenase utilizada, como lotes diferentes podem resultar em diferenças marcantes em viabilidades de hepatócitos após digestão 11. Portanto, diferentes lotes...

A suspensão de células de fígado pode ser preparado a partir do fígado por meio de métodos mecânicos ou enzimáticos. Os métodos mecânicos usados ​​para preparar as células do fígado integrais incluem forçando o fígado através de gaze 2, agitando um pedaço de fígado com contas de vidro em uma coqueteleira Kahn 3, utilizando homogeneizadores de vidro com pilões soltas 4,5 etc Ao longo dos anos, os métodos mecânicos caíram fora do favorecem, devido à lesão das membranas das células e a perda da função dos hepatócitos isolados 6,7. Por conseguinte, a utilização de um método enzimático é actualmente o principal método para o isolamento de hepatócitos. Isolamento de hepatócitos, utilizando um método enzimático aumentou quando Berry e amigo 8 perfusão colagenase e hialuronidase através do fígado através da veia porta em ratos. Este processo de perfusão utilizado vasculatura para permitir que os enzimas a entrar em contacto estreito com a maioria das células, o que leva aum aumento de 6 vezes no rendimento de hepatócitos 8. Além disso, este método produziu células que retinham a sua integridade estrutural, com virtualmente nenhuma transformação do retículo endoplasmático em vesículas isoladas e sem dano mitocondrial 8. Este método foi modificado por Seglen 1, que foi pioneiro de um procedimento de perfusão de duas etapas para o isolamento das células do fígado. Neste procedimento, o fígado de rato é perfundido com uma Ca2 + livre tampão seguido por perfusão com um tampão de colagenase contendo Ca 2 + 1. A remoção de Ca 2 + no primeiro passo ajuda a romper desmossomas, enquanto a adição de Ca 2 + no segundo passo é necessário para a actividade da colagenase ideal 1,9. Dado que os trabalhos publicados acima descrito foi realizado em ratos, este artigo destina-se a demonstrar um procedimento modificado, que pode ser usado para isolamento de hepatócitos com alta viabilidade de zumbidoum fígado. O uso de hepatócitos humanos continua a ser importante para a investigação de translação e para a validação de experimentos com modelos animais. Os pedaços de fígado humano utilizados neste estudo foram adquiridos com o consentimento para a governança por meio da Fundação de Pesquisa de Tecidos Humanos e celular, uma fundação sem fins lucrativos controlada pelo Estado 10. Depois de um patologista removido o que era necessário para o diagnóstico, pedaços de fígado foram coletadas a partir do tecido remanescente. O tecido seccionado pelo patologista foi morfologicamente tecido saudável obtida a partir de margens de ressecção após a ressecção hepática.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass jacketed condenser</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 &deg;C Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>35723-H24/EG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &deg;C Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)</td>
			<td>Linde</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas permeable tubing</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>2-4440</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>IP65</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>320010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5171014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 1 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 5 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121673</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2110654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352075</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5144063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved irrigation cannulae with ball tips</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vascular clamps</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HT38.1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 210 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 70 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1419</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m sterile filters</td>
			<td>Peske</td>
			<td>99505</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180154</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Peske</td>
			<td>06-0001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120,086</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>1508454</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Pasteur pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorised pipette filler (Pipette boy acu)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Hera safe-KS9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator (Low-flow surgical suction pump)</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>C361</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Gas Burner</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Fire Boy eco</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable laboratory coat</td>
			<td>Paperlynen GmbH</td>
			<td>MD0202414</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical mask with visor</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>48247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical hood</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>42072</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Semper Care</td>
			<td>CE0321</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Batch number NB 4G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>17465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26868</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>01400-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Serva</td>
			<td>22700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>30180</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold storage solution</td>
			<td>Hepacult GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure

O fígado, um órgão com capacidade de regeneração excepcional, realiza uma ampla gama de funções, como a desintoxicação, metabolismo e homeostase. Como tal, os hepatócitos são um modelo importante para uma grande variedade de questões de pesquisa. Em particular, o uso de hepatócitos humanos é especialmente importante nas áreas de farmacocinética, a toxicologia, a regeneração do fígado e investigação de translação. Assim, este método apresenta uma versão modificada de um procedimento de perfusão com colagenase em dois passos para isolar hepatócitos como descrito por Seglen 1. Anteriormente, os hepatócitos foram isolados por métodos mecânicos. No entanto, os métodos enzimáticos têm sido mostrados como sendo superior como hepatócitos mantêm a sua integridade estrutural e a função, depois do isolamento. Este método aqui apresentado adapta o método concebido anteriormente para os fígados de ratos aos pedaços de fígado humano e resulta num grande rendimento de hepatócitos com uma viabilidade de 77 ± 10%. A principaldiferença neste processo é o processo de canulação dos vasos sanguíneos. Além disso, o método aqui descrito também pode ser aplicado a partir de fígados de outras espécies com tamanhos do fígado ou dos vasos sanguíneos comparáveis.

Configuração de Perfusão Os equipamentos necessários para a perfusão hepática deve ser configurado de acordo com a Figura 1. Viabilidade e Rendimento de isolado hepatócitos humanos A viabilidade média de hepatócitos humanos isolados foi de 77 ± 10% eo rendimento médio dos hepatócitos foi de 13 ± 11 milhões de hepatócitos / g de fígado, com valores expressos em média ± desvio padrão. O número de isolament...

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Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Um procedimento de duas etapas de perfusão de colagenase modificado para isolamento de hepatócitos humanos é descrita. Este método também pode ser aplicado a outros fígados de mamíferos. Os hepatócitos isolados estão disponíveis em alto rendimento e viabilidade, tornando-os um modelo adequado para a investigação científica em áreas como a regeneração do fígado, farmacocinética e toxicologia.

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Biologia

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal<em&gt; In situ</em&gt; Perfusão de fígado

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Exame<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval células terminais traqueais por microscopia de luz

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Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...