Name: isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure at JoVE.com

Detta arbete har gjorts möjlig genom den mänskliga vävnader och celler Research Foundation, som gör mänskliga vävnader tillgängliga för forskning. Ekonomiskt stöd till detta arbete kom från förbundsministeriet för utbildning och forskning (bidrag namn: Virtual Lever Network, licensnummer: 0.315.759) och Hepacult GmbH. Vårt tack går också till de tekniska experter från Grosshadern Sjukhusvävnadsbank för insamling av leverprover och de tekniska konsulter från Cell Isolation Core Facility för att utföra levern perfusion och hepatocyte isolering. Framför allt vill vi tacka Natalja Löwen för att demonstrera detta förfarande i videon. Slutligen vill vi tacka Natalja Löwen och Edeltraud Hanesch för att skapa illustrationer till figur 1 och figurerna i den schematiska översikten i videon.

1. Beredning av perfusion och Isolation Solutions <ol><li> Bered lösningar krävs för perfusion av levern stycket och isolering av hepatocyter i enlighet med tabell 1. Lösningar kan förvaras vid 4 ° C fram till användning. </li><li> Sterilfiltrera alla lösningar med användning av ett 0,22 ^ m filter. </li><li> Alla lösningar som kommer i kontakt med levern bör vara sterila. </li></ol> 2. Beredning av Perfusion utrustning och lösningar <ol><li> Utrustning för perfu...

<ol>
	<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Schneider, W. C., Potter, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assay+of+animal+tissues+for+respiratory+enzymes+II.+Succinic+dehydrogenase+and+cytochrome+oxidase.">The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).</li><li>Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+Binucleate+Cell+Counts+in+Resting+and+Regenerating+Rat+Liver+Employing+a+Mechanical+Method+for+the+Separation+of+Liver+Cells.">A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells.</a> Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).</li><li>Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mass+Isolation+of+Whole+Cells+from+Rat+Liver.">The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver.</a> Science. 117, 627-628 (1953).</li><li>Jacob, S. T., Bhargava, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Method+for+Preparation+of+Liver+Cell+Suspensions.">New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions.</a> Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).</li><li>Berry, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Properties+of+Cells+Isolated+from+Adult+Mouse+Liver.">Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver.</a> Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).</li><li>Laws, J. O., Stickland, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+Isolated+Liver+Cells.">Metabolism of Isolated Liver Cells.</a> Nature. 178, 309-310 (1038).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Rat-Liver+Cells+.3.+Enzymatic+Requirements+for+Tissue+Dispersion.">Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion.</a> Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).</li><li>Thasler, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charitable+State-Controlled+Foundation+Human+Tissue+and+Cell+Research:+Ethic+and+Legal+Aspects+in+the+Supply+of+Surgically+Removed+Human+Tissue+For+Research+in+the+Academic+and+Commercial+Sector+in+Germany.">Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany.</a> Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).</li><li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver.">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Pure+Hepatocytes+and+Reticuloendothelial+Cells+in+High-Yield+from+a+Single-Rat+Liver+by+Means+of+Percoll+Centrifugation+and+Selective+Adherence.">Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence.</a> J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).</li><li>Cantrell, E., Bresnick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzpyrene+Hydroxylase-Activity+in+Isolated+Parenchymal+and+Nonparenchymal+Cells+of+Rat-Liver.">Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver.</a> Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).</li><li>Weiskirchen, R., Gressner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of hepatic stellate cells.</a> Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steatotic+versus+cirrhotic+livers+as+a+source+for+human+hepatocyte+isolation.">Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation.</a> Transplant P. 33, 664-665 (2001).</li><li>Renz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+extended+donor+criteria+liver+allografts+maximizes+donor+use+and+patient+access+to+liver+transplantation.">Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation.</a> Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).</li><li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+donor+criteria+have+no+negative+impact+on+early+outcome+after+liver+transplantation:+a+single-center+multivariate+analysis.">Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis.</a> Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).</li><li>Alexandre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pre-,+intra-+and+post-operative+parameters+of+donor+liver+on+the+outcome+of+isolated+human+hepatocytes.">Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+review:+Hemostats,+sealants,+and+adhesives+II:+Update+as+well+as+how+and+when+to+use+the+components+of+the+surgical+toolbox.">State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox.</a> Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).</li><li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostats,+sealants,+and+adhesives+III:+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox.">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li><li>Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotoxicity+of+cyanoacrylate+tissue+adhesives.+A+comparative+study.">Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study.</a> Archives of otolaryngology--head &amp; neck surgery. 116, 546-550 (1990).</li><li>Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histotoxicity+of+cyanoacrylates.+A+selective+review.">The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review.</a> Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).</li><li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue:+a+one+hundred+liver+experience.">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222 (2011).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li><li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices.">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The principles of humane experimental technique. , (1959).</li></ol>

Detta protokoll resulterar i isolering av humana hepatocyter med hög livsduglighet och renhet. För att uppnå dessa resultat, är det viktigt att börja med en lämplig bit av levern. Den bit av levern bör ha intakt Glisson kapsel på alla ytor utom 1 snittyta. En annan viktig faktor är den speciella sats av kollagenas som används, eftersom olika satser kan resultera i markanta skillnader i viabilitet av hepatocyter efter digestion 11. Därför bör olika partier av kollagenas testas och det parti som pr...

En levercellsuspension kan framställas från levern genom mekaniska eller enzymatiska metoder. Mekaniska metoder som används för att framställa hela leverceller inkluderar tvinga levern genom cheesecloth 2, skakar en lever stycke med glaspärlor i en Kahn skakapparat 3, med användning av glas-homogenisatorer med lösa pestles 4,5 etc. Under årens lopp har mekaniska metoder fallit ur gynna grund av skador på cellmembran och förlust av funktionen hos de isolerade hepatocyter 6,7. Följaktligen är användningen av en enzymatisk metod som för närvarande den huvudsakliga metoden för isolering av hepatocyter. Isolering av hepatocyter med hjälp av en enzymatisk metod förbättrades avsevärt när Berry och Friend 8 perfusion kollagenas och hyaluronidas genom levern via portalen ven hos råttor. Denna perfusion process utnyttjas vaskulaturen för att tillåta enzymerna att komma i nära kontakt med huvuddelen av cellerna, vilket leder tillen 6-faldig ökning i utbyte av hepatocyter 8. Vidare gav denna metod celler som behållit sin strukturella integritet, med praktiskt taget ingen omvandling av endoplasmatiska nätverket i isolerade blåsor och inga mitokondriell skada 8. Denna metod modifierades av Seglen 1, som banat väg för en två-steg perfusion förfarande för levercellisolering. Vid detta förfarande är det råttlever perfunderad med en Ca2 +-fri buffert följt av perfusion med en kollagenasbuffert innehållande Ca 2 + 1. Avlägsnandet av Ca 2 + i ett första steg hjälper till att störa desmosomer, medan tillsatsen av Ca 2 + i det andra steget erfordras för optimal genasaktivitet 1,9. Med tanke på att det publicerade arbetet som beskrivs ovan har utförts på råtta, denna artikel syftar till att visa en modifierad procedur som kan användas för isolering av hepatocyter med hög lönsamhet från humen levrar. Användning av humana hepatocyter fortfarande viktigt för translationell forskning och för att validera försök med djurmodeller. De humana leverbitar som används i denna studie har förvärvats med samtycke för styrning via mänskliga vävnader och celler Research Foundation, en statskontrollerad ideell stiftelse 10. Efter en patolog bort vad som krävs för diagnos, var leverbitar som samlats in från den kvarvarande vävnad. Vävnaden sektioneras av patologen var morfologiskt frisk vävnad erhålls från resektion marginaler efter leverresektionskirurgi.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass jacketed condenser</td>
			<td>Ga&szlig;ner Glastechnik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 &deg;C Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>35723-H24/EG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &deg;C Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>1083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)</td>
			<td>Linde</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas permeable tubing</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>2-4440</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>IP65</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>320010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5171014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 1 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flasks 5 L</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2121673</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2110654</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352075</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5144063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved irrigation cannulae with ball tips</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vascular clamps</td>
			<td>Ernst Kratz GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HT38.1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 210 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh 70 &mu;m</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1419</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m sterile filters</td>
			<td>Peske</td>
			<td>99505</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>2180154</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Peske</td>
			<td>06-0001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120,086</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>1508454</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Pasteur pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorised pipette filler (Pipette boy acu)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155017</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refridgerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Hera safe-KS9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator (Low-flow surgical suction pump)</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>C361</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Gas Burner</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Fire Boy eco</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable laboratory coat</td>
			<td>Paperlynen GmbH</td>
			<td>MD0202414</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical mask with visor</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>48247</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical hood</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>42072</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Semper Care</td>
			<td>CE0321</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Batch number NB 4G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>17465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26868</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>01400-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Serva</td>
			<td>22700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>30180</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold storage solution</td>
			<td>Hepacult GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure

Levern, ett organ med en exceptionell förmåga till återväxt, utför en mängd olika funktioner, såsom avgiftning, metabolism och homeostas. Som sådana hepatocyter är en viktig modell för en stor mängd olika frågeställningar. I synnerhet är särskilt viktigt när det gäller farmakokinetik, toxikologi, lever förnyelse och translationell forskning användning av humana hepatocyter. Således presenterar denna metod en modifierad version av en tvåstegs kollagenasperfusion förfarande för isolering av hepatocyter, såsom beskrivs av Seglen 1. Tidigare har hepatocyter isolerats med mekaniska metoder. Emellertid har enzymatiska metoder visat sig vara överlägsen som hepatocyter bibehåller sin strukturella integritet och funktion efter isolering. Metoden presenteras här anpassar metod utformad tidigare för råttlevrar till humana leverbitar och resulterar i ett stort utbyte av leverceller med en bärkraft på 77 ± 10%. Den huvudsakligaskillnaden i detta förfarande är en process för cannulization av blodkärlen. Vidare kan den här beskrivna metoden även tillämpas på levrarna från andra arter med jämförbara lever-eller kärlstorlekar.

Perfusion Setup Den utrustning som krävs för leverperfusion bör inrättas enligt figur 1. Lönsamhet och avkastning av isolerat humana hepatocyter Den genomsnittliga lönsamheten för isolerade humana hepatocyter var 77 ± 10% och den genomsnittliga avkastningen av hepatocyter var 13 ± 11 miljoner hepatocyter / g lever, med värden som uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Antalet hepatocyte isoleringar utförs...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure at JoVE.com

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

En modifierad två steg kollagenas perfusion procedur för isolering av humana hepatocyter beskrivs. Denna metod kan också tillämpas på andra däggdjurs levrar. De isolerade hepatocyter finns med högt utbyte och lönsamhet, vilket gör dem en lämplig modell för vetenskaplig forskning inom områden som lever förnyelse, farmakokinetik och toxikologi.

Isolering av humana hepatocyter med två steg kollagenas perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolering av råttfibroblaster portalen<em&gt; In situ</em&gt; Leverperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Mus Islet Langerhanska Isolering med en kombination av renat kollagenas och neutralt proteas

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Hans rening: En två-stegs Affinity Purification protokoll Flytfullängds renade proteiner

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Undersökning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Trakealtuber Terminal Celler med ljusmikroskop

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Protokoll för isolering av primära humana hepatocyter och Motsvarande Större populationer av icke-parenkymala leverceller

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

En tvåstegsstrategi som kombinerar epigenetisk modifiering och biomekaniska ledtrådar för att generera däggdjurs pluripotenta celler

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Isolering av primära råtthepatocyter med multiparameterperfusionskontroll

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...