Name: motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Kucenas Lab for værdifulde diskussioner og Quorum Technologies, Inc. enestående teknisk support. Arbejdet blev støttet af UVa Fund for Excellence i Videnskab og Teknologi (FEST) (SK).

1.. Forberedelse og Montering af Zebrafisk embryoner til ablation og live Imaging <ol><li> Forbered en bestand på 0,8% lavtsmeltende agarose i æg vand. Alikvot ind 13X 100 mm engangs podningsrør og opbevares ved 4 ° C indtil de skal bruges. </li><li> Cross voksen zebrafisk indeholdende stabilt integreret transgener til fluorescens mærke motoriske neuroner og glia celletyper af interesse. Saml zebrafisk embryoner æg vand og plads i 28,5 ° C inkubator for korrekt iscenesættelse senere 3.. </li><li> P?...

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

De mest kritiske trin i denne eksperimentelle design er: 1) korrekt montering larver for skader og efterfølgende in vivo imaging og 2) kalibrere laseren og vælge de korrekte strømindstillinger for at skabe et rent nerve transection, der resulterer i minimal ekstra vævsskader . For at sikre en vellykket axotomi til in vivo billeddannelse og efterfølgende analyse, montere flere larver enten på individuelle glasbund retter eller i en glasbund skål med delere. Når du har kalibreret laser, anbefaler...

Zebrafisk er blevet brugt i udstrakt grad til at studere udviklingen af ​​nervesystemet på grund af deres optiske transparens og lethed af transgenese, som når den kobles, tillader spektakulær billeddannelse af dynamiske celle adfærd hos et levende foster. Derudover, fordi zebrafisk og pattedyr deler næsten alle de gener, der er nødvendige for nervesystemet dannelse, cellulær og molekylær information indsamlet i denne model organisme er direkte relateres til andre hvirveldyr. Selvom utrolig kraftfuld for neurale udviklingsmæssige undersøgelser, har zebrafisk og dets unikke egenskaber potentiale til også belyse de mekanismer, der opretholder og genopbygge nervesystemet efter skade. Zebrafisk larver opretholde deres gennemskinnelighed i sene larvestadier og pigmentering effektivt kan blokeres med enten brug af farmakologisk inhibitorer af melanin produktion eller genetiske mutanter, der mangler pigment celler. Således at bruge denne model organisme studere skade og GENERATORISKion i ældre dyr er mulig og giver en unik mulighed for direkte at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der genopbygge nervesystemet. I dette manuskript, beskriver vi, hvordan man effektivt og reproducerbart skade nerverne i PNS af zebrafisk larver. Denne skade paradigme egner sig til at studere ikke blot degeneration, men også svarene fra perifere glia og immunceller samt samspillet mellem disse populationer under regenerering. PNS er et komplekst netværk af motoriske og sensoriske nerver, der er nødvendig for at passere oplysninger mellem det centrale nervesystem (CNS) og huden, organer og muskler i kroppen, så en organisme til at interagere med sine omgivelser og overleve. Langs disse nerver. Perifer glia, herunder myelinerende og ikke-myelinerende Schwann-celler og perineurial glia samt bindevæv, omslutter axoner og i sidste ende danner modne nerve Skade af disse nerver indleder en proces known som Wallerian degeneration 10.. Denne mekanisme axonal fragmentering, immun rekruttering, vragrester clearance og regenerering er meget stereotypt og genetisk reguleret 1.. Tidligere undersøgelser i mammale systemer har beskrevet roller Schwann-celler under nerve degeneration og regeneration 1, 2, 6, 8. I disse studier af fast væv eller cellekultur, ikke kun Schwann celler rekrutteret makrofager til skaden site for at hjælpe med vragdele clearance, men også hjulpet i myelin fagocytose selv. Mens disse undersøgelser har været utrolig informativ, vi har aldrig før visualiserede gliale reaktioner på perifer Axon skade in vivo i realtid, og ingen andre studier har undersøgt sammenhængen mellem de forskellige klasser af perifer glia i disse begivenheder. Senest er flere laboratorier undersøgt Wallerian degeneration ved hjælp zebrafisk og laser-medieret Axon skade svarer til, hvad vi beskriver her <sup&gt; 4, 5, 7, 9. I nogle af disse undersøgelser blev overfladiske sensoriske axoner axotomized i unge larver ved hjælp af en specialbygget, to-foton konfokal mikroskop 4, 5, 9. I en anden undersøgelse er der meget lig vores eget, blev dybere axoner i ventrale motorisk nerve transected i 5 dage gamle larver anvendelse af et kommercielt tilgængelig laserablation systemet 7.. I begge disse eksperimentelle set-ups, var der fokus på Wallerian degeneration og både axoner og immunceller blev afbildet. At udvide disse undersøgelser beskriver vi sårede motoriske axoner i ældre larver med mere modne, myelinerede nerver og assay respons af al nerve-associeret perifer glia under degeneration og regeneration. For at gøre dette, vi transektere motoriske nerver i 6 og 7 dag efter befrugtning (DPF) larver og visualisere svarene enkelte gliale befolkninger samt undersøge samspillet mellem disse populationer langs tilskadekomne axoner. Brug dobbelt og tredobbelt transgenic linjer, etiket perifer glia, herunder Schwann-celler og perineurial glia, samt en markør for axoner, bruger vi en kommercielt tilgængelig laser ablation system bestående af en nitrogen-pumpet farvelaser (bølgelængde 435 nm) fastgjort til en roterende skive konfokalt systemet at skabe Axon transections. Denne eksperimentelle set-up giver os mulighed for at visualisere levende, larve zebrafisk, såre specifikke perifere motoriske Axon skrifter og time-lapse billede svarene fra forskellige gliaceller befolkninger til Axon skade og deres forhold til hinanden. Denne protokol kan tilpasses yderligere til at skabe nerve skader i zebrafisk af forskellige aldre, med forskellige transgene linier eller genetiske mutanter til at løse forskellige videnskabelige spørgsmål.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

Nervesystemet ofte beskrevet som et hard-wired del af kroppen, selv om det er et væsentligt flydende organsystem, der reagerer på eksterne stimuli på en konsekvent, stereotyp måde, samtidig med at utrolig fleksibilitet og plasticitet. I modsætning til centralnervesystemet (CNS), det perifere nervesystem (PNS) er i stand til væsentlig reparation, men vi har kun lige begyndt at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, som regulerer dette fænomen. Brug zebrafisk som model-system, har vi hidtil uset mulighed for at par regenerative undersøgelser med in vivo imaging og genetisk manipulation. Perifere nerver er sammensat af axoner omgivet af lag af glia og bindevæv. Axoner ensheathed ved myelinerende eller ikke-myelinerende Schwann-celler, der igen er pakket ind i en fascicle af en cellulær kappe kaldet perineurium. Efter en skade, har voksne perifere nerver den bemærkelsesværdige evne til at remove beskadiget axonal snavs og re-innerverer mål. At undersøge roller alle perifere glia i PNS regeneration, vi beskriver her en Axon transection assay, der bruger en kommercielt tilgængelig kvælstof-pumpet dye laser til axotomize motoriske nerver i live-transgene zebrafisk. Vi beskriver yderligere metoder til at parret disse eksperimenter til time-lapse imaging af sårede og kontrol nerver. Denne eksperimentelle paradigme kan anvendes til ikke blot at vurdere den rolle, glia spiller i nerveregenerering, men også kan være platform for at belyse de molekylære mekanismer, som regulerer nervesystemet reparation.

Assayet beskrevet her kan anvendes til at vurdere respons af gliaceller og andre nerve-associerede cellepopulationer til aksonal skade in vivo. Movie 1 viser et eksempel på en nerveskade oprettet ved hjælp af denne metode, og svaret fra omgivende gliaceller. Dette eksperiment blev udført i Tg (nkx2.2a: megfp), Tg (olig2: DsRed) zebrafisk, hvor perineurial glia udtrykke en målrettet membran EGFP og motoriske neuroner udtrykker cytosolisk DsRed. Skaden blev foretaget langs rostral pr...

Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Selvom det perifere nervesystem (PNS), er i stand til væsentlig reparation efter skade, er lidt om de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer dette fænomen. Ved hjælp af levende, transgene zebrafisk og en reproducerbar nerve transection assay, kan vi studere dynamiske glialcellelinjer adfærd under nerve degeneration og regeneration.

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging af gliacelle Behaviors Live zebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Akutte Skiver af den voksne Mouse forhjerne

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Fødselsdepression Elektroporation og Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Mouse Akut hjerneskiver

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord transection i larvestadiet zebrafisk

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langsigtet Time Lapse Imaging af Mouse Cochlear Eksplantater

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Ex vivo oculomotor skive kultur fra embryonale GFP-udtrykker mus for tidsforskudt billeddannelse af oculomotor nerve outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...