Name: motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות למעבדת Kucenas לדיונים חשובים וQuorum Technologies, Inc לתמיכה טכנית מעולה. העבודה נתמכה על ידי הקרן למצוינות בUVa מדע והטכנולוגיה (FEST) (SK).

1. הכנה והרכבה של עוברי דג הזברה לאבלציה והדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלאי של 0.8% הנמוך להמיס agarose במי ביצה. Aliquot לתוך 13X 100 מ&quot;מ צינורות תרבות חד פעמי ולאחסן ב 4 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה מבוגר צלב המכיל transgenes משול?...

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

השלבים הקריטיים ביותר של עיצוב ניסיוני זה הם: 1) כמו שצריך זחלים גובר על פגיעה ולאחר מכן in vivo הדמיה ו2) כיול לייזר ובחירת הגדרות צריכת החשמל הנכונה על מנת ליצור חיתוך רוחב עצב נקי שגורם לנזק נוסף רקמות מינימאלית . כדי להבטיח axotomy מוצלח בתחום ההדמיה vivo ונית?...

דג הזברה נעשתה שימוש נרחב ללמוד פיתוח של מערכת העצבים בגלל השקיפות האופטית שלהם וקלות transgenesis, שכאשר יחד, לאפשר הדמיה מרהיבה של התנהגויות תא דינמיות בעובר חי. בנוסף, משום שדג זברה ויונקים חולקים כמעט את כל הגנים הדרושים להיווצרות מערכת עצבים, מידע תאי ומולקולרי שנאסף באורגניזם המודל הזה הוא שאפשר להתייחס באופן ישיר לבעלי חוליות אחרים. אמנם רב עוצמה למחקרים התפתחותיים עצביים, דג הזברה והתכונות הייחודיות שלה יש פוטנציאל גם להבהיר את המנגנונים ששומרים ולבנות מחדש את מערכת העצבים לאחר פציעה. זחלי דג הזברה לשמור על השקיפות שלהם לשלבים מאוחרים של זחל ופיגמנטציה ניתן לחסום ביעילות גם עם השימוש במעכבים פרמקולוגיים של ייצור המלנין או מוטציות גנטיות שאין תאי פיגמנט. כך, באמצעות אורגניזם מודל זה ללמוד פציעה וregeneratיון בבעלי חיים מבוגרים יותר אפשרי ומציע הזדמנות הייחודית לחקור ישירות את המנגנונים התאיים ומולקולריים שלשקם את מערכת העצבים. בכתב יד זה, אנו מתארים כיצד ביעילות ובreproducibly לפגוע בעצבים בPNS של זחלי דג הזברה. הפרדיגמה פגיעה זו משאיל את עצמו ללימוד לא רק התנוונות, אלא גם את התגובות של גליה היקפית ותאים של מערכת חיסון, כמו גם את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה במהלך התחדשות. את PNS הוא רשת מורכבת של עצבים תחושתיים ומוטורי שיש צורך להעביר מידע בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואת העור, איברים והשרירים בגוף, המאפשר לאורגניזם כדי אינטראקציה עם סביבתו ולשרוד. לאורך העצבים האלה, גליה היקפית, כולל תאי myelinating ולא myelinating-שוואן וגליה perineurial, כמו גם רקמות חיבור, לשים בארגז את האקסונים והסוף של דבר יוצר את העצב הבוגר. פציעה של עצבים אלה יוזמת תהליך kNown כWallerian ניוון 10. מנגנון זה של פיצול axonal, גיוס חיסונית, שחרור מפסולת והתחדשות הוא מאוד סטריאוטיפי וגנטי מוסדר 1. מחקרים קודמים במערכות יונקים שתיארתי את התפקידים של תאי שווא במהלך הניוון עצבי ו1 ההתחדשות, 2, 6, 8. במחקרים של רקמות קבועה או תרבית תאים הללו, תאי שוואן גויסו לא רק מקרופאגים לאתר פציעה כדי לסייע בפינוי פסולת, אלא גם סייעו במיאלין phagocytosis עצמם. בעוד שמחקרים אלה היו אינפורמטיבי מאוד, יש לנו שלא היו מעולם תגובות גליה מדמיינים לפציעת האקסון ההיקפית in vivo בזמן אמת, ולא מחקרים אחרים בדקו את הקשר בין המעמדות של גליה היקפית השונות במהלך אירועים אלה. לאחרונה, מספר מעבדות חקרו ניוון Wallerian באמצעות דג הזברה ופציעת האקסון לייזר בתיווך דומה למה שאנו מתארים כאן <sup&gt; 4, 5, 7, 9. בחלק מהמחקרים אלה, האקסונים חושיים שטחיים היו axotomized בזחלים צעירים באמצעות מובנה מותאם אישית, מיקרוסקופ 4 שני הפוטונים confocal, 5, 9. במחקר אחר, שהוא מאוד דומה לשלנו, האקסונים עמוקים בתוך העצב המוטורי הגחון היו transected בזחלים בן 5 יום באמצעות מערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי 7. בשתי להגדיר קופצים הניסיוניים הללו, הדגש היה על ניוון Wallerian ושני האקסונים ותאים חיסוניים הם צלמו. להרחבה על מחקרים אלה, שאנו מתארים פציעת אקסונים מוטוריים בזחלים מבוגרים עם, עצבי myelinated בוגרים יותר וassay התגובה של כל גליה עצבים ההיקפית הקשורים בניוון והתחדשות. כדי לעשות זאת, אנחנו transect עצבים מוטוריים ב6 ולאחר הפריה 7 יום (DPF) זחלים ולדמיין את התגובות של אוכלוסיות גליה בודדות, כמו גם לחקור את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה לאורך אקסונים פגועים. באמצעות טרה כפולה ומשולשתקווי nsgenic שגליה היקפית תווית, כולל תאי שוואן וגליה perineurial, כמו גם כסמן לאקסונים, אנו משתמשים במערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי בהיקף של חנקן נשאב צבע לייזר (אורך הגל nm 435) המחובר למערכת confocal דיסק ספינינג כדי ליצור transections האקסון. זה מאפשר ניסיוני הגדרתנו לדמיין חיה דג הזברה, הזחל, לפגוע בשטחים ספציפיים היקפיים מוטוריים האקסון וזמן לשגות תמונה את התגובות של אוכלוסיות שונות גלייה לפציעת האקסון ומערכת היחסים שלהם אחד לשנייה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם יותר ליצירת פציעות עצב בדג זברה בגילים שונים, עם קווים מהונדסים שונים או מוטציות גנטיות כדי לענות על שאלות מדעיות שונות.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

מערכת העצבים מתוארת לעתים קרובות כמרכיב ומקודד היטב בגוף גם אם היא מערכת איברים במידה ניכרת נוזל שמגיבה לגירויים חיצוניים, באופן עקבי, סטריאוטיפי, תוך שמירה על גמישות ופלסטיות מדהימה. בניגוד למערכת העצבים המרכזי (CNS), מערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי, אבל אנחנו רק עכשיו התחלנו להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש בדג זברה כמערכת מודל, יש לנו הזדמנות חסרת תקדים לכמה מחקרי משובי עם in vivo הדמיה ומניפולציה גנטית. עצבים היקפיים מורכבים מהאקסונים מוקפים בשכבות של גליה ורקמות חיבור. אקסונים הensheathed ידי myelinating או אי myelinating-תאי שוואן, שהם בתורם עטוף לתוך fascicle ידי נדן סלולרי נקרא perineurium. בעקבות פציעה, יש עצבים היקפיים למבוגרים יכולת יוצאת דופן לרמהפגום יש פסולת axonal ומטרות מחדש innervate. כדי לחקור את התפקידים של כל גליה ההיקפית בהתחדשות PNS, אנו מתארים כאן assay חיתוך רוחב האקסון המשתמש בליזר צבע זמין מסחרי חנקן נשאב לaxotomize עצבים מוטוריים בדג זברה מהונדס חי. בנוסף, אנו מתארים את השיטות לכמה ניסויים אלה לזמן לשגות הדמיה של עצבים פגועים ושליטה. פרדיגמה ניסויית זה יכול לשמש לא רק כדי להעריך את התפקיד שמחזה גליה בהתחדשות עצב, אבל יכול להיות גם הפלטפורמה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים תיקון מערכת עצבים.

Assay המתואר כאן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את התגובה של תאי גלייה ואוכלוסיות תאי עצב אחרים הקשורים לפציעת axonal in vivo. סרט 1 מציג דוגמה לפגיעה בעצב שנוצר באמצעות שיטה זו והתגובה של סביבת תאי גלייה. ניסוי זה בוצע ב Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (olig2: DsRed) דג הזברה, שבו גליה perin...

Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...