Name: motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il Lab Kucenas per preziosi discussioni e Quorum Technologies, Inc. per il superbo supporto tecnico. Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo UVa per l&#39;eccellenza nella scienza e la tecnologia (FEST) (SK).

1. Preparazione e montaggio di embrioni di zebrafish per l&#39;ablazione e vivo Imaging <ol><li> Preparare uno stock di 0,8% basso punto di fusione agarosio in acqua uovo. Aliquota in 13X 100 millimetri tubi cultura usa e getta e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Croce zebrafish adulto contenenti transgeni integrati stabilmente per etichettare fluorescenti i neuroni motori e tipi di cellule gliali di interesse. Raccogliere embrioni di zebrafish in acqua uovo e mettere in 28,5 ° C incubatore ...

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Le fasi più critiche di questo disegno sperimentale sono: 1) correttamente larve montaggio per lesioni e successive imaging in vivo e 2) calibrare il laser e selezionando le impostazioni di alimentazione corrette per poter creare una transezione del nervo pulita che provoca danni extra-tessuto minimal . Per contribuire a garantire un assotomia successo per l&#39;imaging in vivo e successiva analisi, montare larve multiplo in entrambi i singoli piatti con fondo di vetro o in un piatto fondo di vetro co...

Zebrafish sono stati ampiamente utilizzati per studiare sviluppo del sistema nervoso a causa della loro trasparenza ottica e facilità di transgenesi, che, se accoppiato, permettere spettacolare imaging comportamenti delle cellule dinamiche in un embrione vivente. Inoltre, poiché zebrafish e mammiferi condividono quasi tutti i geni necessari per la formazione del sistema nervoso, informazione cellulare e molecolare raccolte in questo organismo modello è direttamente riferibile ad altre specie di vertebrati. Anche se incredibilmente potente per gli studi sullo sviluppo neurale, il pesce zebra ed i suoi attributi unici hanno il potenziale per chiarire anche i meccanismi che mantengono e ricostruire il sistema nervoso dopo l&#39;infortunio. Zebrafish larve di mantenere la loro traslucenza in stadio avanzato larvali e la pigmentazione può essere efficacemente bloccato sia con l&#39;uso di inibitori farmacologici della produzione di melanina o mutanti genetici che mancano di cellule del pigmento. Così, con questo organismo modello per studiare lesioni e Rigeneranteione negli animali più vecchi è possibile e offre l&#39;opportunità unica di studiare direttamente i meccanismi cellulari e molecolari che ricostruire il sistema nervoso. In questo manoscritto, si descrive come ferire in modo efficiente e riproducibile nervi delle PNS di larve di zebrafish. Questo paradigma lesioni si presta a studiare non solo degenerazione, ma anche le risposte di cellule gliali periferico e cellule immunitarie nonché le interazioni tra queste popolazioni durante la rigenerazione. SNP è una rete complessa di nervi motori e sensori che è necessario per passare informazioni tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la cute, organi e muscoli del corpo, permettendo un organismo di interagire con l&#39;ambiente e sopravvivere. Lungo questi nervi, glia periferica, comprese le cellule mielinizzanti e non mielinizzanti Schwann e glia perineurale, così come tessuto connettivo, racchiudono gli assoni e infine formare il nervo maturo. Infortunio di questi nervi avvia un processo di Known come walleriana degenerazione 10. Questo meccanismo di frammentazione assonale, reclutamento immunitario, la clearance detriti e la rigenerazione è molto stereotipata e geneticamente regolato 1. Studi precedenti in sistemi di mammifero hanno descritto i ruoli delle cellule di Schwann durante degenerazione del nervo e rigenerazione 1, 2, 6, 8. In questi studi di tessuto fisso o coltura cellulare, cellule di Schwann reclutati non solo macrofagi al sito di lesione per aiutare nella liquidazione detriti, ma anche aiutati in mielina stessi fagocitosi. Anche se questi studi sono stati incredibilmente informativo, non abbiamo mai visualizzate risposte gliali a danno degli assoni periferici in vivo, in tempo reale, e non altri studi hanno indagato il rapporto tra le diverse classi di cellule gliali periferico durante questi eventi. Recentemente, molti laboratori hanno indagato degenerazione Walleriana utilizzando zebrafish e lesioni assone laser-mediata simile a quello che abbiamo descritto qui <sup&gt; 4, 5, 7, 9. In alcuni di questi studi, gli assoni sensoriali superficiali sono stati axotomized in giovani larve con un costruito su misura, a due fotoni microscopio confocale 4, 5, 9. In un altro studio, che è molto simile al nostro, assoni più profondi all&#39;interno del nervo motore ventrale sono stati tagliati di 5 giorni vecchio larve utilizzando un sistema di ablazione laser disponibili in commercio 7. In entrambi questi nelle configurazioni, l&#39;attenzione si è concentrata sulla degenerazione Walleriana ed entrambi gli assoni e cellule immunitarie sono stati ripresi. Per approfondire questi studi, si descrive ferendo assoni motori in larve anziani con più maturi, nervi mieliniche e analisi della risposta di tutti glia nervo periferico associata durante la degenerazione e rigenerazione. Per fare questo, abbiamo transetto nervi motori a 6 e 7 giorni dopo la fecondazione (DPF) larve e visualizzare le risposte delle singole popolazioni gliali e indagare le interazioni tra queste popolazioni lungo gli assoni danneggiati. Utilizzando doppie e triple TRALinee nsgenic che etichetta glia periferico, comprese le cellule di Schwann e glia perineurale, così come un marcatore per assoni, si usa un sistema di ablazione laser disponibile in commercio costituito da un azoto-pompato dye laser (lunghezza d&#39;onda 435 nm) collegata ad un sistema confocale disco rotante per creare assoni transections. Questo set-up sperimentale ci permette di visualizzare in diretta, zebrafish larvale, ferire specifici tratti di assoni motori periferici e di immagine al rallentatore le risposte delle popolazioni gliali distinte al danno assonale e la loro relazione l&#39;uno all&#39;altro. Questo protocollo può essere ulteriormente adattato per creare lesioni nervose in zebrafish di età diverse, con diverse linee transgeniche o mutanti genetici per affrontare diverse questioni scientifiche.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

Il sistema nervoso è spesso descritto come componente hard-wired del corpo, anche se si tratta di un sistema di organi considerevolmente fluido che reagisce a stimoli esterni in maniera stereotipata coerente, pur mantenendo un&#39;incredibile flessibilità e plasticità. A differenza del sistema nervoso centrale (SNC), il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativa, ma abbiamo appena iniziato a comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando zebrafish come sistema modello, abbiamo l&#39;opportunità senza precedenti di studi rigenerativi coppia con l&#39;imaging in vivo e di manipolazione genetica. Nervi periferici sono composti di assoni circondati da strati di cellule gliali e tessuto connettivo. Gli assoni sono ensheathed da mielinizzanti o non mielinizzanti cellule di Schwann, che sono a loro volta avvolto in un fascicolo da una guaina cellulare chiamato il perinevrio. A seguito di un infortunio, nervi periferici adulti hanno la straordinaria capacità di remove danneggiato detriti assonale e obiettivi re-innervano. Per studiare i ruoli di tutti glia periferica in PNS rigenerazione, descriviamo qui un saggio transection assone che utilizza un laser a colorante disponibile in commercio azoto pompato a axotomize nervi motori in vivo zebrafish transgenico. Approfondiremo i metodi di accoppiare questi esperimenti di time-lapse imaging di nervi feriti e di controllo. Questo paradigma sperimentale può essere utilizzato non solo per valutare il ruolo che giocano glia in rigenerazione nervosa, ma può anche essere la piattaforma per chiarire i meccanismi molecolari che governano riparazione del sistema nervoso.

Il saggio descritto qui può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule gliali e altre popolazioni di cellule nervose associate al danno assonale in vivo. Filmato 1 mostra un esempio di una lesione del nervo creato con questo metodo e la risposta delle cellule gliali circostanti. Questo esperimento è stato eseguito in Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) zebrafish, in cui glia perineurale esprimono una membrana mirata EGFP e motore neuroni esprimono citosolico DsRed. I...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l&#39;infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

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