Name: motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00
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著者は見事な技術サポートのための貴重な議論とクォーラム·テクノロジーズ·インクのためKucenasラボに感謝したいと思います。仕事は、科学技術の卓越性のためのUVA基金（FEST）（SK）によってサポートされていました。

1。アブレーションとライブイメージングのためのゼブラフィッシュ胚の作製と取り付け<ol><li>卵水に0.8％低融点アガロースの株式を準備します。 4で13X 100ミリメートル使い捨て培養管や店舗°Cに分注し、必要になるまで。 </li><li>蛍光運動ニューロンと関心のグリア細胞型にラベルを安定的に統合された導入遺伝子を含む大人のゼブラフィッシュを渡り。正しいステージングのため℃インキ...

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

この実験的なデザインの中で最も重要なステップは次のとおりである：1） 生体内イメージングと2 の怪我とその後のために適切に取り付け幼虫）クリーン神経切断を作成するために、レーザーを校正し、正しい電源設定を選択することを最小限の余分な組織の損傷につながる。 in vivoイメージングとその後の分析で成功するための軸索切断を確保するために、個々?...

ゼブラフィッシュがあるため、その光学透明の神経系の発達を研究し、遺伝子導入のしやすさ、その結合されたときに、生きている胚の動的細胞挙動の壮大なイメージングを可能にするために広く使用されてきた。ゼブラフィッシュと哺乳類は、ほぼすべての神経系の形成、このモデル生物で収集細胞および分子情報に必要な遺伝子の共有しているため、さらに、他の脊椎動物種に直接話すことのできるある。神経発達研究のための信じられないほど強力なものの、ゼブラフィッシュとそのユニークな属性も損傷後の神経系を維持し、再構築のメカニズムを解明する可能性を秘めている。ゼブラフィッシュの幼虫は、後期幼生期に彼らの半透明性を維持し、色素沈着を効果的にメラニン生成や色素細胞を欠いている遺伝的変異体の薬理学的阻害剤の使用のいずれかをブロックすることができます。このように、けがやregeneratを勉強するために、このモデル生物を用いた高齢動物でイオンが可能であり、直接神経系を再構築する細胞および分子メカニズムを調査するためのユニークな機会を提供しています。本稿では、効率的かつ再現ゼブラフィッシュ幼生のPNSの神経を傷つける方法を説明します。この傷害パラダイムは退化しないだけの勉強に向いてだけでなく、周辺グリアと免疫細胞の応答と同様に、再生時のこれらの集団間の相互作用。 PNSは、生物がその環境と相互作用し、生き残るできるように、中枢神経系（CNS）および皮膚、臓器や身体の筋肉間で情報を渡す必要がある運動感覚神経の複雑なネットワークである。髄鞘形成と非ミエリンシュワン細胞と神経鞘グリアならびに結合組織、軸索包む、最終的に成熟した神経を形成するなど、これらの神経に沿って、周辺グリア、。これらの神経の損傷は、プロセスkを開始するウォーラー変性10としてノウン。軸索の断片化、免疫募集、破片クリアランスと再生のこのメカニズムは1非常に紋切り型と遺伝的に規制されています。哺乳動物系における以前の研究では、神経変性および再生1、2、6、8時のシュワン細胞の役割を記載している。固定組織または細胞培養のこれらの研究では、シュワン細胞だけでなく、デブリクリアランスを助けるために、損傷部位へのマクロファージを採用し、また、ミエリン貪食自体が支援。これらの研究は非常に有益であったが、我々はリアルタイムでin vivoでの末梢軸索損傷に可視化グリア応答前に決して持っていないし、他の研究では、これらのイベントの間に周辺グリアの異なるクラス間の関係を調査していない。 最近では、いくつかのラボは、我々がここで説明するものと同様のゼブラフィッシュとレーザー媒介軸索損傷を使っウォーラー変性を検討してきた<sup&gt; 4、5、7、9。これらの研究のいくつかでは、表面的な感覚の軸索は、カスタム構築された、二光子共焦点顕微鏡4、5、9を使用して、若い幼虫に軸索切断された。私たち自身に非常に類似している別の研究では、腹側運動神経軸索内のより深い、市販のレーザーアブレーションシステム7を使用して5日齢の幼虫に離断された。これらの実験のセットアップの両方では、焦点は、ウォーラー変性と軸索の両方と免疫細胞画像化した上にあった。これらの研究に展開するには、我々はより成熟した、有髄神経とアッセイ変性と再生中にすべての神経関連の周辺グリアの応答と古い幼虫、モータ軸索を負傷​​について説明します。 これを行うには、我々は（DPF）6と7日後の受精で運動神経を横断する幼虫と負傷軸索に沿ってこれらの集団の間の相互作用を調査するだけでなく、個々のグリア細胞集団の反応を可視化する。ダブル、トリプルTRAを使用そのシュワン細胞と神経鞘グリアならびに軸索のマーカーを含むラベル周辺グリア、nsgenicラインは、我々は成る市販のレーザーアブレーションシステム使用スピニングディスク共焦点システムに接続されている色素レーザーは、（波長435 nm）を窒素励起軸索transectionsを作成します。これは実験のセットアップ私たちはお互いに軸索損傷とそれらの関係を特定の末梢運動軸索路とタイムラプス画像異なるグリア集団の応答を傷つけ、ライブ、幼虫のゼブラフィッシュを視覚化することができます。このプロトコルは、さらに別の科学的な疑問を解決するために別のトランスジェニック系統や遺伝的変異と、異なる年齢のゼブラフィッシュの神経傷害を作成するために適応させることができる。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

神経系は、しばしば、それが信じられないほどの柔軟性と可塑性を維持しつつ、一貫した、ステレオタイプの方法で外部刺激に反応する流体かなり臓器系であっても、本体のハードワイヤード成分として記載されている。中枢神経系とは違って（CNS）、末梢神経系（PNS）が重要な修理が可能ですが、私たちはようやく、この現象を支配する細胞および分子メカニズムを理解し始めている。モデル系としてゼブラフィッシュを用いて、in vivoイメージングと遺伝子操作でと夫婦再生の研究に前例のない機会を持っている。末梢神経膠細胞とは結合組織の層に囲まれた軸索で構成されている。軸索は神経周膜と呼ばれる細胞のシースによって束に包まれた順番にあるシュワン細胞、髄鞘形成または非ミエリンによってensheathedされています。損傷後、成人末梢神経は、サンレモに顕著な能力を持っているVE軸索の破片や再支配目標を破損。 PNS再生における全ての周辺グリアの役割を調べるために、我々はここに住んでトランスジェニックゼブラフィッシュの運動神経をaxotomize市販の窒素励起色素レーザーを使用して軸索横断アッセイを説明します。私たちは、さらに負傷者や制御神経のタイムラプスイメージングに結合するように、これらの実験の方法を説明します。この実験的なパラダイムは、グリア細胞は神経再生で再生するだけでなく、神経系の修復を支配する分子メカニズムを解明するためのプラットフォームとなることができます。という役割を評価しないために使用することができます

ここに記載されたアッセイは、in vivoでの軸索損傷に対するグリア細胞および他の神経関連細胞集団の反応を評価するために使用することができる。 ムービー1は、この方法およびグリア細胞周囲の応答を使用して作成された神経損傷の一例を示す図である。 Tgは（olig2：DsRedを）;：この実験は、Tgが（megfp nkx2.2a）で行われた神経鞘グリア細胞がEGFPターゲット?...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...