Name: motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório Kucenas pelas valiosas discussões e Tecnologias de quorum, Inc. Para obter suporte técnico soberbo. O trabalho foi apoiado pelo Fundo UVA de Excelência em Ciência e Tecnologia (FEST) (SK).

1. Preparação e montagem de embriões Zebrafish para ablação e Imagens ao vivo <ol><li> Prepare um estoque de 0,8% de baixa fusão agarose em água ovo. Alíquotas 13X em tubos de cultura de 100 mm descartáveis ​​e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Zebrafish adulto Cruz contendo estavelmente transgenes integrados para rotular fluorescente os neurônios motores e tipos de interesse de células gliais. Coletar embriões zebrafish em água ovo e coloque em 28,5 ° C incubadora para o estadiament...

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Os passos mais críticos da presente delineamento experimental são os seguintes: 1) para a montagem propriamente larvas lesão e subsequente in vivo de imagens e 2) calibrar o laser e escolhendo os ajustes de potência correctos, a fim de criar um corte transversal do nervo limpa que resulta em danos mínimos dos tecidos extra- . Para ajudar a garantir uma axotomia sucesso para in vivo de imagens e posterior análise, montar larvas múltiplas tanto em pratos com fundo de vidro individuais ou em um pra...

Zebrafish têm sido extensivamente usados ​​para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso devido a sua transparência óptica e facilidade de transgénese, que, quando acoplados, para permitir imagiologia espectacular dos comportamentos dinâmicos das células num embrião vivo. Além disso, por causa do peixe-zebra e mamíferos partes quase todos os genes necessários para a formação do sistema nervoso, a informação celular e molecular recolhidos neste modelo organismo é directamente relacionáveis ​​com outras espécies de vertebrados. Embora extremamente poderosa para o estudo do desenvolvimento neural, o peixe-zebra e os seus atributos únicos têm o potencial de também explicar os mecanismos que mantêm e reconstruir o sistema nervoso após a lesão. Larvas de peixe-zebra manter a sua translucidez em estágios larvais tardias e pigmentação pode ser bloqueado, quer com a utilização de inibidores farmacológicos de produção de melanina ou de mutantes genéticos que carecem de células de pigmento. Assim, usando este organismo modelo para estudar lesões e se regeneraion em animais mais velhos é possível e oferece a oportunidade única de investigar diretamente os mecanismos celulares e moleculares que reconstruir o sistema nervoso. Neste artigo, descrevemos como a ferir de forma eficiente e reproduzível nervos nos PNS de larvas de peixe-zebra. Este paradigma lesão presta-se a estudar não só a degeneração, mas também as respostas das células gliais e células do sistema imunológico periférico, bem como as interacções entre estas populações durante a regeneração. O SNP é uma rede complexa de nervos motores e sensoriais que é necessário para passar informação entre o sistema nervoso central (CNS) e na pele, músculo e órgãos do corpo, permitindo que um organismo de interagir com o seu ambiente e sobreviver. Ao longo destes nervos, células gliais periférico, incluindo células mielinizantes e não mielinizantes de Schwann e glia perineural, bem como o tecido conjuntivo, encerram os axónios e finalmente formam o nervo madura. Lesão destes nervos inicia um processo de known como degeneração Walleriana 10. Este mecanismo de fragmentação axonal, recrutamento imunológico, liberação de detritos e regeneração é muito estereotipada e geneticamente regulado 1. Estudos anteriores em sistemas de mamíferos têm descrito as funções das células de Schwann, durante a degeneração do nervo e regeneração 1, 2, 6, 8. Nestes estudos de tecido fixo ou de cultura de células, as células de Schwann, não só recrutados macrófagos para o local da lesão para ajudar na depuração de detritos, mas também ajudou na mielina fagocitose si. Embora esses estudos tenham sido incrivelmente informativo, nunca temos antes de respostas gliais visualizadas a lesão axonal periférica in vivo em tempo real, e não outros estudos investigaram a relação entre as diferentes classes de glia periférica durante esses eventos. Recentemente, vários laboratórios têm investigado a degeneração Walleriana utilizando zebrafish e lesão axonal mediada por laser de semelhante ao que descrevemos aqui <sup&gt; 4, 5, 7, 9. Em alguns desses estudos, os axônios sensoriais superficiais foram axotomizado em larvas jovens usando um costume construído, dois fótons microscópio confocal 4, 5, 9. Em outro estudo, que é muito semelhante à nossa, axônios mais profundas dentro do nervo motor ventral foram seccionados em cinco dias de idade larvas usando um sistema de ablação a laser disponível no mercado 7. Em ambos os experimentais set-ups, o foco foi a degeneração Walleriana e os axônios e células imunológicas foram fotografados. Para ampliar esses estudos, descrevemos ferindo axônios motores em larvas mais velhas, com mais maduras, nervos mielinizados e ensaio a resposta de todos glia nervo periférico associado durante a degeneração e regeneração. Para fazer isso, nós transecto nervos motores de 6 e 7 dias após a fertilização (dpf) larvas e visualizar as respostas das populações da glia individuais, bem como investigar as interações entre essas populações ao longo dos axônios lesionados. Usando tra duplos e triploslinhas nsgenic que a glia periférica etiqueta, incluindo as células de Schwann e glia perineural, bem como um marcador de axónios, que utilizam um sistema de ablação a laser disponíveis no comércio consistindo de um átomo de azoto-de corante bombeado a laser (comprimento de onda de 435 nm) ligado a um sistema de disco giratório confocal para criar axônio transecções. Este experimental set-up permite visualizar ao vivo, peixe-zebra larval, ferir imagem time-lapse as respostas das populações da glia distintos tratos dos axônios motores periféricos específicos e à lesão axonal e sua relação com o outro. Este protocolo pode ainda ser adaptado para criar lesões nervosas em zebrafish de diferentes idades, com diferentes linhagens transgênicas ou mutantes genéticos para abordar diferentes questões científicas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

O sistema nervoso é frequentemente descrito como um componente de hard-wired do corpo, mesmo que seja um sistema de órgãos consideravelmente fluido que reage a estímulos externos em uma maneira consistente estereotipado, mantendo ao mesmo tempo a flexibilidade e plasticidade incrível. Ao contrário do sistema nervoso central (SNC), o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa, mas apenas começaram a compreender os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando zebrafish como um sistema modelo, temos a oportunidade sem precedentes para estudos regenerativos casal com in vivo de imagens e manipulação genética. Os nervos periféricos são compostos de axónios rodeado por camadas de células gliais e de tecido conjuntivo. Axônios são ensheathed por myelinating ou não células mielinizantes de Schwann, as quais são, por sua vez envolvida num fascículo por uma bainha celular chamado o perineuro. Após uma lesão, nervos periféricos adultos têm a notável capacidade de remove danificado detritos axonal e alvos de re-inervam. Para investigar os papéis de todos os glia periférica na regeneração PNS, descrevemos aqui um ensaio transection axônio que usa um laser de corante disponível comercialmente nitrogênio bombeado para axotomize nervos motores em zebrafish transgênicos ao vivo. Descrevemos ainda mais os métodos para casal estas experiências à imagem time-lapse de nervos lesados ​​e controle. Este paradigma experimental pode ser utilizado não só para avaliar o papel que desempenham na glia regeneração do nervo, mas pode também ser a plataforma para elucidar os mecanismos moleculares que governam a reparação do sistema nervoso.

O ensaio aqui descrito pode ser usado para avaliar a resposta das células da glia e outras populações de células nervosas associadas a lesão axonal in vivo. Filme 1 mostra um exemplo de uma lesão do nervo criada usando este método e a resposta de células vizinhas gliais. Este experimento foi realizado em Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed) zebrafish, no qual glia perineural expressar uma membrana alvo EGFP e neurônios motores expressa cytosolic DsRed. A lesão foi feito ao ...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Neurociência

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...