Name: motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Лаборатории Kucenas за ценные обсуждения и кворум Technologies, Inc для превосходной технической поддержкой. Работа выполнена при поддержке Фонда UVA, за выдающиеся достижения в науке и технике (FEST) (SK).

1. Подготовка и монтаж Эмбрионы рыбок данио для абляции и живых изображений <ol><li> Готовят на 0,8% с низкой температурой плавления агарозы в воде яйцо. Алиготе в 13Х 100 мм одноразовые пробирки культуры и хранят при температуре 4 ° С до использования. </li><li> Крест взрослых данио стабильно интег...

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Наиболее важных шагов этого эксперимента являются: 1) правильно монтажа личинки за травмы и последующей визуализации in vivo и 2) калибровка лазера и выборе правильных параметров питания для того, чтобы создать чистую перерезки нерва, что приводит к минимальным экстра-повреждение тка...

Данио рерио широко используются для изучения развития нервной системы, потому что их оптических прозрачность и легкость трансгенеза, что в сочетании, позволяют захватывающий визуализации динамических характеристик ячейки в живом эмбриона. Кроме того, поскольку данио рерио и млекопитающих делать почти все гены, необходимые для формирования нервной системы, клеточные и молекулярные информация, собранная в этой модели организм непосредственно Relatable других видов позвоночных. Несмотря на невероятно мощный для нейронных исследований развития, данио а его уникальные свойства имеют потенциал, чтобы также лучше понять механизмы, которые поддерживают и восстановлению нервной системы после травмы. Данио личинки сохраняют свою прозрачность в конце личиночной стадии и пигментация может быть эффективно блокируют или использование фармакологических ингибиторов производства меланина или генетических мутантов, которые не имеют пигментных клеток. Таким образом, используя эту модель организма для изучения травм и Regeneratиона в старых животных можно и предлагает уникальную возможность непосредственно исследовать клеточные и молекулярные механизмы, которые восстановлению нервной системы. В этой рукописи, мы опишем, как эффективно и воспроизводимо повредить нервы в ПНС личинки данио. Это повреждение парадигма поддается изучению не только дегенерации, но и ответов периферической глии и иммунных клеток, а также взаимодействие между этими группами населения в процессе регенерации. ПНС представляет собой сложную сеть моторных и сенсорных нервов, которые необходимо передавать информацию между центральной нервной системы (ЦНС) и кожи, органов и мышцы тела, что позволяет организму взаимодействовать с окружающей средой и выжить. Вдоль этих нервов, периферических глии, в том числе миелинизирующих и не миелинизирующих шванновских клеток и периневральной глии, а также соединительную ткань, упаковывают аксонов и в конечном счете образуют зрелый нерва. Повреждение этих нервов инициирует процесс KNown как Wallerian дегенерации 10. Этот механизм аксонов фрагментации, иммунные набора, оформления и мусора регенерации очень стереотипно и генетически регулируется 1. Предыдущие исследования в системах млекопитающих описали роль шванновских клеток в процессе дегенерации нерва и 1 регенерации, 2, 6, 8. В этих исследованиях основных тканей или клеточных культур, Шванн клетки не только работу макрофагов в месте повреждения, чтобы помочь в зазор мусора, но и помогают в себя фагоцитоза миелина. Хотя эти исследования были невероятно информативным, мы никогда раньше не визуализированы глиальных ответов на повреждение периферического аксона в естественных условиях в реальном времени, и никакие другие исследования не исследовали взаимосвязь между различными классами периферической глии во время этих событий. В последнее время несколько лабораторий исследовали Wallerian дегенерации использованием данио и лазерно-опосредованной травмы аксона подобно тому, что мы описываем здесь <sup&gt; 4, 5, 7, 9. В некоторых из этих исследований, поверхностный сенсорных аксонов были аксотомизированных в молодые личинки использованием индивидуальному заказу, двухфотонные конфокальной микроскопии 4, 5, 9. В другом исследовании, которое очень похоже на наш собственный, более глубокие аксонов в вентральной двигательного нерва были перерезаны в 5 дневных личинок с использованием коммерчески доступной системой лазерной абляции 7. В обоих этих экспериментальных установок, акцент был сделан на Wallerian дегенерация и как аксонов и иммунные клетки были обследованы. Расширить свое присутствие на этих исследованиях, мы описываем ранив двигателя аксонов у пожилых личинки с более зрелыми, миелиновых нервы и анализа характеристик всех нервных соответствующие периферийные глии при дегенерации и регенерации. Чтобы сделать это, мы секут двигательных нервов в 6 и 7 день после оплодотворения (DPF), личинок и визуализировать ответов отдельных глиальных населения, а также исследовать взаимодействие между этими группами населения по поврежденных аксонов. Использование двойных и тройных траnsgenic линий, которые этикетке периферийных глии, в том числе Шванн клетки и периневральной глии, а также в качестве маркера для аксонов, мы используем имеющиеся в продаже системы лазерной абляции состоящей из атома азота накачкой лазером на красителе (длина волны 435 нм), прикрепленный к вращающемуся диску конфокальной системы создать transections аксона. Это экспериментальная установка позволяет визуализировать живые, личиночной данио, ранить конкретных периферийными Мотор аксонов путей и покадровой изображения ответов различных групп населения к глиальных травмы аксонов и их связь друг с другом. Этот протокол может быть дополнительно адаптирована для создания повреждений нерва у рыбок данио разных возрастов, с разными трансгенных линий или генетических мутантов для решения различных научных вопросов.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

Нервная система часто описывается как проводных компонентов тела, хотя это значительно жидкости системы органов, которая реагирует на внешние раздражители, в последовательном, стереотипно, сохраняя невероятную гибкость и пластичность. В отличие от центральной нервной системы (ЦНС), периферической нервной системы (ПНС) способна значительным ремонта, но мы только начали понимать, клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют этим явлением. Использование данио в качестве модельной системы, у нас есть беспрецедентная возможность пару регенеративной исследования с прижизненного изображения и генетических манипуляций. Периферических нервов состоят из аксонов, окруженные слоями глии и соединительной ткани. Аксоны ensheathed по миелинизирующих или не миелинизирующих Шванн клетки, которые в свою очередь завернуты в пучок по сотовому оболочка называется периневрии. После травмы, взрослые периферических нервов имеют замечательную способность Ремове повреждены аксональное мусора и повторного Озарение целей. Для исследования роли всех периферийных глии в регенерации ПНС, мы опишем здесь анализа перерезки аксона, который использует коммерчески доступного азота накачкой лазером на красителе для axotomize двигательных нервов в живых трансгенных данио. Мы также описать методы, чтобы соединить эти эксперименты, чтобы покадровой съемки потерпевшего и контроля нервы. Эта экспериментальная парадигма может быть использована не только для оценки той роли, которую играют в глии регенерации нервов, но также может быть платформой для выяснения молекулярных механизмов, которые регулируют нервные системы ремонта.

Анализа, описанного здесь, могут быть использованы для оценки реакции глиальных клеток и других нервов связанных клеточных популяций на аксонального повреждения в естественных условиях. Фильм 1 показан пример повреждения нерва созданный с помощью этого метода и реакции...

Watch this Scientific Journal Video about Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish at JoVE.com

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Несмотря на то, периферической нервной системы (ПНС) способна значительным ремонт после травмы, мало известно о клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют этим явлением. Использование живых трансгенных данио и воспроизводимые анализа перерезки нерва, мы можем изучать поведение динамических глиальных клеток во время дегенерации и регенерации нервов.

Мотор Перерезка нерва и Покадровый Визуализация глиальных клеточных поведений в Живом данио рерио

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Методы экспериментальных манипуляций после оптические Перерезка нерва в ЦНС млекопитающих

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Покадровый Визуализация нейробластов миграции в остром ломтики мозга взрослых мышей

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Перерезки спинного шнур в личиночной данио рерио

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Ex Vivo Oculomotor Slice Культура от эмбриональных GFP-Expressing мышей для Time-Lapse Imaging Oculomotor Нерв Рост

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D кинематический анализ для функциональной оценки в Крыса Модель Сиатический нерв Давка травмы

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Временной live Imaging и количественной быстрой динамики дендритной ветви в разработке дрозофилнейронов

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Очистка фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов в vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...