Name: intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00
Duration: 11 min 53 s
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1。電極および生理食塩液の調製<ol><li>動物が解剖される前に、生理食塩水と電極を準備します。 115.3のNaCl、1.8のCaCl 2、4.0のKCl、10 mMトリス/マレイン酸またはHEPES：ヒルリンゲル液は、以下で構成されています。 pHを7.4に調整する。 </li><li>ワイヤーがスムーズに濃いグレー仕上げになるまで20分間漂白剤を少量に掃除銀線を浸漬またはによるAg-Clでワイヤーを準備します。使用する前に蒸留水でワイヤーを洗ってください。その後、アンプに差し込むマイクロピペットホルダーにワイヤーを配置。 </li><li>ピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスのシャープなガラス電極を準備します。電極抵抗は20MΩのオーダーである必要があります。 </li><li> 3Mの酢酸カリウム溶液でピペットを埋め戻すとマイクロピペットホルダーに内に挿入します。 </li><li>細胞外電極用で、バック先端を破る、上記のような鋭利なガラスピペットを準備鋭いエッジの近くに別の鋭いピペットをこする。それは接続詞を引き裂くしないように先端を磨く発射。プラスチック外電極は限り電極と神経の間の良好な接触があるように動作します。 </li><li>吸引用のゴムチューブと注射器が装備されて銀（Ag-Clでワイヤー付き）マイクロピペットホルダーに細胞外記録電極を挿入します。少なくとも銀線の高さまで電極に生理食塩水を描画するために注射器を使用してください。 </li><li>特定の信号記録部の取扱説明書に従うことによって、ハードウェア（アンプ、刺激アイソレータ）とソフトウェア記録パラメータを設定します。以下の実験で使用される機器の詳細を表示するLeksrisawat ら 22を参照してください。 </li></ol> 2。腹側神経節の解剖<ol><li>リーチリンゲル液で大規模なシリコーンエラストマーが並ぶ皿にリーチを解剖。動物が縦延伸された場合、それは意志腹側神経索（ 図1A参照 ）を削除する方が簡単。 </li><li> ＃10または＃11サイズのメスで、腹側正中での非常に浅い切り傷に縦切開を行います。腹側のカットの途中2/3rdについて、図1（b）に示します。動物が完全に開放され、血液洞がまっすぐに伸ばされるまでの黒ストッキング（腹側血液洞）を切断しないようにしてください。この血液洞は、腹側正中に沿って動物の長さを実行します。 VNCは、この血管の内部に含まれている。 </li><li>皮膚はニックへの血液洞（ 図2）微細な虹彩はさみを使用し、動物の完全な長さに切断された後。洞の下で細かいアイリスハサミの刃1をスリップし、少し神経組織からそれを分離するためのブレードを上げる。神経根、分節神経、または神経節の間に接続詞を回避しながら洞に、VNCの長さをカットします。 </li><li>次に、で腹側神経索の一部を除去血管が根に参加するところに遠位根を切断。腹側神経索の長さに沿って、各節ごとにこの手順を繰り返します。 </li><li>小さいペトリ皿に1または2神経節のセグメントを転送します。神経節または単一神経節は、いくつかのたるみをピンと張ったピン止めする必要があります。 </li><li>神経節神経膠シースが少しグリアシースを通って、目的の神経細胞に突き刺すとき動き回るから神経細胞体を防ぐために引き伸ばされるように接続詞や根をピン。ピンは、根、黒洞を通って、軸索の損傷（ 図3）を最小化するには、2つの結合子の中央に配置する必要があります。 </li><li>顕微鏡下準備とペトリ皿を置き、動きを防ぐために、皿の底にワックスで固定します。 </li><li>慎重に、図4（a）のように神経細胞を見て、ミラーと集光を用いた光ビームを集束（概略図4Bに示されている</st栄&gt;）。神経節の中心部にある二つの大きなレチウス細胞に注目してください。 </li><li> Rzは、T、P、およびN個のニューロンの細胞内記録を作るために、慎重に目的の細胞上には、電極の先端を配置し、静かにディンプルがグリア鞘に見られるまで、先端を下げる。 </li><li>電極先端が目的の細胞に「飛び出す」ように（非常に慎重に）電極ホルダまたはマニピュレータをタップします。 </li><li>活動電位を呼び起こすために細胞内に正の電流（1-10 NA）の短パルス（30〜40ミリ秒）を注入。 </li></ol> 3。腹側神経節の準備から培養したニューロン<ol><li>ウシ胎児血清（FCS）（ 図3）L-15を含有する清浄な皿に神経節の腹側を上にピン。細胞内記録のために上に行ったように神経節が少し伸びているように、根をピン。細かいハサミで、ニック·一端のグリアカプセルは、その後グリアカプセルを横断、カプセルの下に1はさみの刃を滑ら図5Aに示すように、 </li><li> 15分間シェーカー上皿の場所にコラゲナーゼ/ディスパーゼ100μlのアリコートを加える。公開される細胞体の周りに培養培地を移動させることで、細胞を調べる。細胞は、最小限の吸引で出てくるまで、さらに15分以上振とう機にセルを返します。 </li><li>そっと神経節から細胞を抽出するために注射器に取り付けたピペットを使用してください。それは細胞体の直径よりもわずかに大きくなるように火がピペット先端を研磨する。大人のリーチでのRzのセルの場合、直径が約50μmにする必要があります。 </li><li>これは、ピペットの内側に付着した細胞の可能性を減少させるようにフィラメントずに、直径の異なるピペットの様々な準備をします。チッピングからヒントを保護するために、下部の綿球を使用して、80％エタノール（エタノール）を含む瓶の中にピペットを保管してください。細胞を吸引する前に、媒体とピペットからエタノールを洗うことを忘れないでください。 </li><li>酵素処理した後、洗い流す2X（FCSを含む）、L-15を有する酵素を含む培地。目的の細胞を同定し、ゆっくりと注射器（ 図6A）引いて、ピペットにそれらを描画します。 （FCSを）、L-15を含む別の皿に吸引セルを放電。 </li><li>今までは、すべての手順は、非滅菌した。無菌フードで次の手順を実行します。無菌ペトリ皿の内側の異なる場所に（FCSを）無菌のL-15の3-4大滴を配置します。 </li><li>それらを洗浄するには、ドロップの周りにそれらを吹いて、前のような滴の1に細胞をピペット。培地の3または4滴シリーズでこれを繰り返します。 </li><li> （FCSを）L-15で満たされたきれいなペトリ皿に細胞を配置します。 </li><li>室温で1から24時間のために細胞をインキュベートします。その後きれいな細胞がメッキすることができる。数時間あるいは細胞を残すことによって、一晩の細胞外マトリックスは簡単に外れます。長いプロセスを生成するために、すぐに細胞をプレート。 </li><li>マイクロジをコーティングするために、無菌の基板を使用<html> SHで、それを実験を培養する前に、（一晩）完全に乾燥させます。 </li><li>皿を塗布した後、L-15培地の少量、次いで滅菌水で穏やかに皿を洗浄し。 FCSを含まないL-15のソリューションを使用することを忘れないでは、細胞がディッシュに接着させるために追加。細胞が基材に接着した後、培地を穏やかにFCSとL-15に変更することができる。細胞がプレーティング後数時間使用される場合には、FCSでL-15培地への切り替えは不要である。 </li><li>位置めっき時に互いに隣り細胞は急速なシナプス形成（ 図6B）を誘導する。ニューロンのペアでの24時間の尺度で生理活性の後。 </li><li> （第二細胞内電極を用いたペアの細胞からの細胞内電極と記録の応答を通じて1ニューロンを刺激する）は、細胞の培養されたペアでRPまたはシナプス応答を記録するために、細胞内の電気生理学的手法を使用してください。 </li></ol>タイトル &quot;&gt; 4。神経節ボディウォール準備<ol><li>上記のようなエラストマーで裏打ち皿にダウンヒル背側をピン。 </li><li>切断された神経の反対側にルーツを持つ片側に皮膚（ 図7（b）に拡大された図7Aを ）ピンまたは身体へのすべてのルーツを持つ神経節（ 図7C）上のリーチの腹側面に窓を作るそのまま壁。 </li><li>感覚細胞（T、P、N）は火が軽く、同じセグメントの肌に触れないように研磨された小さなガラス棒を使用してのいずれかで安定した細胞内記録を取得した後。から記録されたニューロンは、Nセルである場合、それ以上の圧力が皮膚に適用される必要がある。皮膚をピンセットで挟持されている場合、ほとんどの場合、Nセルにのみ応答する。 1が皮膚に損傷を与えたり、そのような方法で準備を乱すことにより、細胞内の再コーディングを置き換える可能性があるため、このような理由から、これらの細胞は最後に試行すべきである。 </li><li>一つは、あるべき十分にすぐに十分な詳細と、皮膚や神経節をスケッチすることができ、その触れた1が特定のニューロンに対する受容野を決定するために使用することができる場所のマップ。神経節の両側に可能な限り多くのTとP細胞から記録した後にN個のセルを試してみてください。 </li><li>感覚ニューロンは吻側または尾側の方法で、その後、皮膚に隣接するセグメントの根出接続詞を通過のプロセスを持っているかどうかを調べるためには、に関しての神経節の間に接続詞をカットすることができ、受容野は再検討検出の普及。受容野のロスがあった場合には、基本的に1を検討しています。 </li></ol> 5。蛍光色素を注入する<ol><li>上記のようなリーチの神経節を準備します。 </li><li>ルシファーイエロー-CH（3.0％）及び塩化リチウム（300ミリモル）の溶液を微小電極を埋める。 </li><li>説明したように神経節の腹側の感覚細胞またはRzの細胞の1を突き刺す上記の。 </li><li> 15分間電極を介して負の電流（3NA）を渡すことによって、細胞内に色素を注入する。 100ミリ秒と2 Hzまでの周波数にパルス幅を設定します。 </li><li>水銀ランプやFITC / GFPフィルターセットでエキサイティングな色素により、色素で満たされた神経細胞を可視化する。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

この一連の実験の目的は、1）指導、展示細胞内記録の基本原則を特定可能なニューロンからと2）大人のヒルを使用して、これらの特定の神経細胞のタイプから発生する可能性が電気信号の特徴的な形状を認識するようにすることでした。神経生理学的な調査·研究のためのリーチを使用して調査の豊かな歴史は、開発時だけでなく、シナプス修復および再生10の間、神経回路と遺伝子制御の問題に対処する上で進行中であります。ニューロモデュレーションは、特に生体アミン経路を介して、また、リーチで成功した研究の方向となっている。生理食塩水を介して中枢神経系へのドーパミンおよび他の薬理学的薬剤を添加することにより、ドーパミンが意思決定挙動24,25をクロールするためのモータ23と、パターンに関与する神経回路網を調節することが示されている。この実験的なアプローチは、あほですル（かつ安価）教授の研究室に変調を組み込むための方法、および生理食塩水のイオン化粧を調整するには、ネルンストゴールドマン·ホジキン·カッツの方程式を教えるための効果的な方法です。 神経節の準備と成功するためには、神経節前細胞内電極と細胞体を突くしようとすると張りつめていることが重要です。グリアパケットを押し下げた場合、その他の相馬が移動します。培養のための神経細胞を除去するための神経節をdesheathingとき神経を横断する際にこれらが削除されるように細胞体が損傷していないので、また、関心のある領域を避ける。また、酵素の過剰なインキュベーションは、ニューロンが削除されるにはあまりにも脆弱なものになることがあります。酵素の各バッチは、彼らの行動が若干異なるため、理想的なインキュベーション時間を達成するために、いくつかの試行錯誤が必要です。 培養培地を最適化するためのさらなる調査は、この方法を改善することができる。バリ例えば、インスリン、糖、または増殖因子の存在などのOU因子は、培養物の維持のために、より長い検査することができる。細胞は、Rzの細胞におけるセロトニン合成のような送信機を合成する能力を維持するかどうかを判断するには、ニュートラルレッド染色は、セロトニン作動性のプロセスをラベルに適用することができます。負傷し、組織再生にもミクログリア侵入が損傷後の核しみ日によって定量化することができる。 この準備は、再生および修復だけでなく、神経回路を調べるに提供する多くの利点がありますが、シナプスでの様々な受容体サブタイプの薬理学的および分子識別が十分に特徴付けられていない。発現配列タグライブラリが26用意されており、薬用ヒルゲノムは、現在27を組み立てているが、一部のモデルの製剤に比べてリーチの主な制限は、特定の細胞型に選択的な遺伝子についてゲノムを変更する機能です。胚Tにその制限は、28遺伝子発現を調節するDNAまたはdsRNAを注入することによって対処されてきた。遺伝子銃技術が最近リーチニューロンにおいて無脊椎動物コネキシン（innexin）タンパク質を発現するために使用されている。 ヒルドverbana（HVE-inx6）からinnexinの発現は、薬用ヒル29内の異所性ギャップ結合の形成のために十分である。薬用ヒル-またはHそれは30だったとしてバーベナは、今後数年間で電気シナプスの生理学と進化の理解を進めることでしょう。

リーチの準備が特定できる（感覚、運動、動物の中枢神経系（CNS）内でインターニューロンの機能を調査するのに便利です。リーチの神経細胞の有用な特性は、その活動電位および生物物理学的特性の形状はのために特徴的であるということである所与の細胞型（ すなわち P、N、T、Rz）はまた、ニューロン細胞があれ45日1,2ためのそれらの電気的特性を維持する適切な培地中で培養した動物から除去することができる。 電気生理学的記録を作る方法を学習するためのリーチの神経節の明確な利点は、細胞が特徴的にかつ確実に神経節にし、動物から動物に神経節とは異なる細胞種の同定を可能にするパターンで神経節内に配置されているということです。ユニークなロケーションとリーチ神経節の神経細胞の形態は、早ければ1891年3としてレチウスで注目された。目の知識電子同一性およびニューロンの機能は、神経回路を調査するため、所与の細胞型を用いた実験を行うのに有利である。による神経節内のニューロンの比較的大きな細胞体にそれらを解剖顕微鏡で可視であり、かつ細胞体を選択的にそれらの電気的特性を記録するための微小電極で突き刺され得る。 染料及び大分子は、個々の細胞およびパッチクランプによって研究チャネル特性に注入することができる。様々な神経細胞に特徴的な活動電位の様々な形状を生じるイオン電流は4-7同定されている。神経支配のパターンで調査し、CNS内の個々のニューロンの分岐から、シナプス結合は、識別されたニューロン2,8と文化の中で再現されている。リーチの神経節における研究では、Wholおよびでだけでなく、電気生理学を用いて測定することができる機能的な回路の開発への洞察を提供してきたE動物行動の研究。リーチは、CNSはまた、動物全体での文化4-6,9-12における神経修復および再生に関与するメカニズムを研究するための貴重な準備を務めている。 哺乳類の脳では、個々の識別された神経細胞の性質や接続の面での挙動を説明するための困難な作業である。原則として1は、リーチとしてはあまり複雑なシステムの研究では、高等動物で使用される基本的なメカニズムを定義するために助けることができることを願っています。水泳パターン13,14と心臓15のリズムの根底に使用されている接続がうまくリーチで特徴づけられている。電気的および化学的の両方の通信を形成するために、いくつかのリーチニューロンの能力が興味深い。他は単方向に化学が、双方向の電気7ている間、いくつかの接続が双方向である。動物内のシナプス結合を理解するだけでなく、同​​じ標準を再作成培養皿内の接続のeは、シナプス形成16〜18だけでなく、シナプス19の薬理学的プロファイリングを調査するための強力なツールです。ここで説明する細胞内記録と刺激技術は、薬理学的アッセイおよび神経動物行動学と開発研究のための基盤を提供します。 また、分節腹側神経索の神経支配、皮膚のパッチで解剖することができる。生きている皮膚のパッチと神経細胞を維持する能力、感覚受容野は、CNS内のそれぞれの腹部神経節内の感覚ニューロンの細胞体（ すなわち細胞体）からの電気信号を記録することで調べることができる。それによって、1は皮膚に力を様々な程度を適用することにより、感覚終末の感度を評価し、受容野をマップすることができます。軽いタッチ、圧力、および有害（痛みを伴う）20,21を刺激。 このリーチ神経節の皮膚の準備の利点は、1 CAN解剖学的に受容野マップを描き、電気的応答が記録されて一旦同定ニューロンへの神経突起をトレースします。以下の3つのリーチ実験は、すべての学術研究室のために、このコスト効果的な教育モジュールを作る単一の検体で複数回完了することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

淡水ヒル、 ヒルドmedicinalisは 、神経生理学、神経動物行動学、発生生物学の分野で科学的問題に対処するために使用されている汎用性の高いモデル生物である。この報告書の目的は、他の神経系製剤における専門知識を持つ生理学者に使用されるであろう、あるいはほとんど、またはまったく電気生理学の経験を持つ生物学の学生に一つの記事にリーチのシステムからの実験技術を統合することです。私たちは、神経節内の識別された神経回路から細胞内に記録するためのリーチを分析する方法を示します。次に、既知の機能を個々の細胞はシャーレに培養する神経節から削除する方法を示し、どのように文化の中で、これらのニューロンから記録します。その後、我々は、感覚や運動のフィールドをマッピングするために使用される神経支配皮膚のパッチを準備する方法を示しています。これらのリーチ製剤はまだ広く神経networの基本的な電気的特性をアドレス指定するために使用されるKS、行動、シナプス形成、および開発。彼らはまた、神経科学や生理学教授の研究室のための適切なトレーニングモジュールである。

リーチの神経節内の感覚ニューロンからの細胞内記録を図4（c）に示す、その個別の電圧-時間トレースによって特徴づけられる。健康なリーチ神経節細胞における休止細胞膜電位は-45〜-60 mVである。電位が小さい（より負）であれば1はガラス電極を変更する必要があり、または潜在的にはまだ低い場合には、神経索の別のセグメントに移動します。小振幅の自発的活動電位は、電極が運動ニューロンであることを示すことができる。これは神経節体壁内に発生する場合、電流注入は、ニューロンがまだ皮膚に取り付けられた筋肉のいずれかを神経支配するかどうかを決定するために使用することができる。環形エレクター運動ニューロン（AE）は神経節（ 図4B）の腹側にあり、それが輪の脊柱の筋肉を活性化することにより、上昇する円環（リッジまたはセグメント）を発生します。 感覚細胞に電流を注入すると、活動電位を呼び起こす必要があります図4Cに示す特性を有する波形sである。波形が異なって見える場合、それはアンバランスブリッジまたはオフセット容量補正が原因である可能性があります。一つは、細胞の内部でブリッジのバランスをとる方法の詳細については、信号取得部に付属のマニュアルを参照する必要があります。 図4Cに電流パルスの最初と最後に刺激アーティファクトに注目してください。これは、ブリッジがバランスしたときの成果物がどのように見えるかである。 リーチの神経節からの神経細胞の初代培養皿内の電気的および化学的シナプスを形成している。最初に培養細胞の電気的特性は、それらがインビボであるとまったく同じではない。しかし、数日後にインパルスが神経節に記録されたものとほとんど区別できます。これは、Rzは細胞の一対図6Cに示されている。培養7時間後にシナプス電位の振幅は1〜2 mVであった。培養SY 56時間後naptic電位は10 MV（ 図6Cのトップトレース）よりも大きかった。活動電位の形状も文化の中で56hr後に変更されます。記載された条件下で、これらの細胞は、数日間生存可能である。 細胞間の通信は、神経根や接続詞を刺激し、神経節の神経細胞から記録することにより証明することができる。これらの神経を刺激すると、別の神経節細胞における強固なシナプス電位と活動電位を発生させる。 図8Bにトレースは、動物から取り出して、皿に出ピン止めされていた神経節でレチウス細胞から記録した。黒いトレースが結合する細胞外電極を適用サブスレッショルド刺激によって誘発された。刺激電圧を大きくすると、細胞が活動電位（赤いトレース）を発射させる。蛍光色素または西洋ワサビペルオキシダーゼは、それらの形態を研究するために、これらの細胞に注入することができる。ルシファーイエローさRzに注入した電極を介して負の電流を流すことによりニューロン。代替的には、空気圧のパフを使用して色素を注入することである。 図9Aは、注入が始まった直後に染料を示している。 30分後、色素が既に神経根（ 図9B）中に拡散していた。色素の種類は、用途に依存するギャップジャンクションを通過することができ、例えば小さな分子量の色素が電気的シナプスを同定するために使用される。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> 図1。腹ヒル郭清（A）は、動物が完全にリーチの生理食塩水で満たされたエラストマーで裏打ち皿に腹側を上に固定されている（B）が 、前方に広がる浅い切開：前後軸が神経の損傷を防ぐために、正中線のすぐ横作られているコー​​ド。ブラックブラッド洞（containsの腹側神経索）を容易に見ることができる。シースに比べて白い1さらさ神経節に注意してください。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> 図2。黒洞の解剖。の血管（矢印）を慎重に腹神経索（二重矢印）を公開するために片側にカットする必要があります。解剖の記録の料理の間で転送するときに腹神経索を操作するためのハンドルとして使用するために、セグメントの根の周りの完全な血管のセグメントのままにしておきます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3"FO：コンテンツ幅= SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot;幅 &quot;3インチ&quot; = &quot;400ピクセル&quot; /&gt; 図3。腹神経索の単離されたセクション。セグメント根上に残っている、血管断片によって腹側神経索の確保と分節接続詞の両端に電気生理学的記録のために神経を公開します。神経節の延伸ピンと張ったは1が識別可能な細胞体を見ることができ、シャープなガラス電極とグリアシースのより容易に浸透できるようになります。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> 図4。リーチの神経節の細胞の解剖学。（A）理想レチウス細胞（R）や他の大規模な細胞体（P-キーを押し顕微鏡と集光が適切に設定されている場合URE、T-タッチ、N-侵害受容、AE-弁輪エレクター）がはっきりと見えるようになります。神経節細胞（B）の模式図である。細胞体の位置のわずかな違いは、神経節が延伸され、ピンと張ったピン止めされているどのようにそれぞれの神経節に発生します。これらのニューロンの細胞体から記録された（C）活動電位が特徴的な波形を持っている。これらのスパイクは、セル（電圧-時間トレースをオーバーレイする矩形パルス）に正の電流を注入することにより誘発された。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> 図5。個々の細胞体を除去して神経節をDesheathing。（A）グリア鞘慎重に関心の損傷細胞を避けるために、神経節を横断する必要があります。赤い線は、Rzのニューロンの細胞体をぶつからないようにカットを示している。シースを開くと、消化酵素が結合組織マトリックスにアクセスすることができます。（B）のグリアシースが開かれた後、神経節の外に膨れ健康な細胞体を。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> 図6リーチ神経節由来のニューロンを培養する。（A）細胞を、マイクロピペットを用いて神経節から吸引し、培養培地を含む皿に転送される。（B）は 、互いに近傍に複数のセルを配置することは、識別可能なニューロン間のシナプス形成の速度を増加させる。ここSTU2つのニューロンのMPSは、シナプスを形成している。（C）ニューロン培養展示わずかに異なる電気的特性に。トップトレースは、細胞を播種した後に、隣接セル7時間と56時間を刺激することにより誘発シナプス電位を示している。下部トレースは直接Rzが細胞のいずれかに電流を注入することによって誘発した。シナプス電位振幅の増加に注意し、文化の中で56時間後に活動電位波形の変化。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> 図7。受容野をマッピングするためのリーチ神経節体壁の準備を。（a）1つのアプローチ1-3神経節に沿って体壁のセクション全体を削除することです。ここでは1側の根はbにしているEENカットし、神経節は側へ固定されています。（B）より高倍率でのピンアウト神経節。（C）別のアプローチは、受容野をマッピングしながら、そのまま神経節から体壁やレコード内の小さなウィンドウを作成することです（DG）は、感覚ニューロンの各々は、機械的刺激に対する応答特性を示す。（D）軽いタッチではなく、PまたはN細胞におけるT細胞における活性を呼び起こす。（E）T細胞応答は、より強いに応答して遮断する刺激、P細胞の活性化への道を与える。刺激が強くなるようにN個のセルは、（FG）活性化される。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figur電子8。 リーチ神経節において活性を誘発。接続詞の細胞外刺激が神経索におけるシナプス伝達を駆動するために使用することができる。（A）は、これは、接続詞のいずれかに吸引電極を取り付け、小さな電圧を印加することによって行われる。シャープなガラス電極（矢印）が神経節にレチウスセルを突き刺す見ることができます。シナプス電位（黒）が続く刺激アーチファクトを示す（B）の電圧-時間トレースと活動電位（赤）。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">拡大表示するには、ここをクリックしてください画像</a> 。 <img alt="図9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> 図9リーチニューロンへの色素を注入する。（A）、ルシファーイエロー、現在のthroを通すことによって細胞体に注入することができる記録微小電極ぐふ。水銀ランプやFITCフィルターセットは、その後、蛍光を可視化するために使用することができます。（B）の染料のRz中に拡散しているの注射後約30分で軸索。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis Video (Video) | JoVE

腹側神経節から神経細胞を培養し、感覚のフィールドをマッピングするために神経支配の皮膚のパッチから記録、腹側神経節の神経細胞からの細胞内記録：この記事では、ヒルを使って3神経系の準備について説明します。

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording (Video) | JoVE 

空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons (Video) | JoVE 

Sf9細胞でとアメフラシ感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージング

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons (Video) | JoVE 

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster (Video) | JoVE 

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo Video (Video) | JoVE

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish Video (Video) | JoVE

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna Video (Video) | JoVE

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons Video (Video) | JoVE

へのガイド<em&gt;インビボ</emOptogenetically同定された皮質抑制性介在から&gt;シングル単位記録

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor Video (Video) | JoVE

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo Video (Video) | JoVE

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...