Name: forward genetic approaches in chlamydia trachomatis
Uploaded: 2013-10-23T18:30:00
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1. Chemischen Mutagenese Hinweis: Es wird festgestellt, dass die replikative Form RB zugänglicher chemische Mutagenese als die EB vorliegt. In der Mitte des Zyklus (zwischen 18 bis 20 hpi), sind bei der größten RBs Zahlen vor RB-EB Übergang. Weil Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazelluläre Erreger, können die Auswirkungen der Mutagen auf dem Host Gesundheit zu begrenzen Bakterienwachstum. Vero-Zellen erwiesen sich als widerstandsfähiger gegen die negativen Auswirkungen...

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	<li>Haggerty, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+sequelae+after+Chlamydia+trachomatis+genital+infection+in+women.">Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women.</a> J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).</li><li>Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+mechanisms+of+Chlamydia+entry.">Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry.</a> Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).</li><li>Hybiske, K., Stephens, R. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Chlamydia+trachomatis+diversity+occurs+by+widespread+interstrain+recombination+involving+hotspots.">Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots.</a> Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).</li><li>DeMars, R., Weinfurter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+gene+transfer+in+Chlamydia+trachomatis+in+vitro,+mechanism+and+significance.">Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance.</a> J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).</li><li>Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+gene+transfer+in+vitro+in+the+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis.</a> J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).</li><li>Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches.">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li><li>Tipples, G., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+initial+characterization+of+a+series+of+Chlamydia+trachomatis+isolates+selected+for+hydroxyurea+resistance+by+a+stepwise+procedure.">Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure.</a> J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).</li><li>Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+trimethoprim-+and+sulphisoxazole-resistant+Chlamydia+trachomatis.">Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis.</a> Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).</li><li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Laboratory+Maintenance+of+Chlamydia+trachomatis.">Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).</li><li>Li, H., Ruan, J., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+short+DNA+sequencing+reads+and+calling+variants+using+mapping+quality+scores.">Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores.</a> Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. 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M., Melian, A., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+by+UvrABC+excinuclease+is+a+step+in+the+path+to+mutagenesis+by+psoralen+crosslinks+in+Escherichia+coli.">Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis,+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).</li></ol>

Diese Methode entspricht den grundlegenden Anforderungen für die genetische Analyse, wie es Verbindung zwischen Genotypen und Phänotypen herstellt. Wichtig ist, dass diese ohne Hilfe üblicher molekulare Werkzeuge für die rekombinante DNA-Transformation und Insertions-Inaktivierung von Genen in Bakterien, die oft eine geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Analyse der Genfunktion in nicht-Modell Mikroben erreicht. Ein kritischer Schritt ist Klonalitätsanalyse von plaquegereinigt Muta...

Die obligat intrazelluläre Bakterium Chlamydia trachomatis Konten für schätzungsweise 2,8 Millionen Genitaltrakt Infektionen pro Jahr in den Vereinigten Staaten (Center for Disease Control) mit assoziierten Folgeerkrankungen wie Adnexitis, ektope Schwangerschaften und Unfruchtbarkeit (1). Chlamydia spp haben eine einzigartige Physiologie mit einem zweiphasigen Entwicklungszyklus bestehend aus zwei Formen: die ansteckende, aber nicht-replizierenden elementaren Körper (EB) und der infektiösen aber replikativen reticulate Körper (RB). Infektion beginnt mit der Befestigung der EBs Epithelzellen durch endoctyotosis (2). Innerhalb einer membrangebundenen Vakuole bezeichnet eine Aufnahme, EBS in die RB Form, die dann repliziert durch binäre Spaltung unterscheiden. In der Mitte des Zyklus, RBs Übergänge zurück in EBs, die dann in den extrazellulären Raum ausgestoßen werden, um neue Runden der Infektion zu initiieren, wenn die Wirtszelle lysiert (3). C. trachomatis istrefraktär Routinemanipulation mit Standard molekulargenetische Werkzeuge, wie gezielte Gen-Ersatz, Transposons und Transduzieren Phagen, die von zentraler Bedeutung für die meisten Studien in Bakteriengenetik haben, ist es unklar, in welchem ​​Umfang einzelne Chlamydia Gene tragen zur Umgehung der angeborenen Immunität , Nährstoff Erwerb, Entwicklung Übergänge oder andere Prozesse wichtig für das Überleben des Erregers in einem eukaryotischen Wirt (4). Folglich bleibt diese Erreger schlecht charakterisiert trotz ihrer klinischen Bedeutung. Die Genome von Chlamydia spp. sind relativ klein (~ 1 Mb) (5) mit mehreren Arten und Biovare sequenziert mit Next Generation Sequencing-Technologien. Vergleichende Genomanalyse von WGS hat einzigartige Einblicke in die Evolution der Chlamydien-Arten und ihre Anpassung an den Menschen (6-8) und in gewissem Umfang zur Verfügung gestellt hat einige Informationen zur Verfügung gestellt, um das Potenzial in Abhängigkeit von Virulenzfaktoren (9, 10). Ter genetischen Vielfalt von klinischen Isolaten angezeigt nicht die Auflösung erforderlich ist, um systematisch Karte die Funktion der meisten Virulenzfaktoren, vermutlich, weil Mutationen in solchen Genen wäre leicht gegen ausgewählt haben. Ohne verwirrende Effekte aus natürlichen Selektion, erbgutverändernd-induced gene Variante mit definierten Tests, die Maßnahme Mängel in der Virulenz, das Spektrum von Mutationen, die befragt werden können, erweitern können gekoppelt. Chemische Mutagene, insbesondere, sind nützlich, da sie null, bedingten, hypomorphen (reduzierter Funktion) zu erzeugen, und hypermorphic (gain of function) Allele. Mit der Ankunft der robusten nächsten Generation Genom-Sequenzierung Technologien können solche Mutationen leicht identifiziert werden und kartiert. Auf diese Weise können starke Assoziationen zwischen Mutationen in einem Gen oder einer genetischen Weg und einem gemeinsamen Phänotyp gebildet werden, wodurch die Anwendung von Vorwärts genetische Ansätze. Die Genomsequenzen von klinischen Stämmen offenbarte mosaicism bwischen Serovare und loci der häufigen Rekombination (11). Empirische Daten der Rekombination wurde durch Co-Infektion von zwei verschiedenen Antibiotika-resistenten Stämmen und Selektion resistenter Dual rekombinanten Nachkommenschaft, die offenbarte genetischen Beiträge von beiden Stämme (12, 13) nachgewiesen. Somit ermöglicht genetischen Austausch zwischen Wildtyp und Mutanten in einem Ko-Infektion Einstellung Trennung von chemisch induzierten Mutationen, die betroffene Gen, das den beobachteten Phänotyp führt zu lokalisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese, WGS, und ein System für die DNA-Austausch innerhalb infizierter Zellen (14) (Abbildung 1) durchzuführen.

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, der Erreger von sexuell übertragbaren Krankheiten und Augeninfektionen bleibt schlecht aufgrund seiner Unnachgiebigkeit der experimentellen Transformation dadurch mit rekombinanten DNA. Wir entwickelten einen Ansatz zur genetischen Analyse in C durchführen trachomatis trotz der fehlenden molekulargenetischen Werkzeugen. Unsere Methode beinhaltet: i) chemische Mutagenese schnell generieren umfangreiche Bibliotheken von genetisch definierten Mutanten mit unterschiedlichen Phänotypen, ii) Whole-Genome Sequencing (WGS), um die zugrunde liegenden genetischen Läsionen abzubilden und Assoziationen zwischen mutierten Gens (s) zu finden und.. eine gemeinsame Phänotyp;. iii) Generierung von rekombinanten Stämmen durch Co-Infektion von Säugerzellen mit Mutante und Wildtyp Bakterien. Dementsprechend konnten wir kausalen Beziehungen zwischen Genotypen und Phänotypen zu etablieren. Die Kopplung von chemisch-induzierte Gen Variation und WGS zu etablieren Korrelat Genotyp-Phänotyp-Assoziationen Should im Großen und Ganzen für die große Liste von medizinisch und ökologisch wichtige Mikroorganismen derzeit unlösbar zu genetischen Analyse.

Die Exposition gegenüber erbgutverändernd führt zu Einschlüssen, die frei von Bakterien, vermutlich wegen der bakteriellen Zelltod erscheinen. Typischerweise wird Serovar LGV-L2 vollständig lysieren infizierten Zellen innerhalb von 48 h nach der Infektion, aber die Behandlung mit Mutagene können diesen Zyklus auf&gt; 90 Stunden zu verlängern. Rund 10% der Einschlüsse werden erwartet zu erholen. In unseren Experimenten infizierten Vero-Zellen mit 20 mg / ml behandelt EMS führte zu einem 99% igen Rückgang bei de...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forschung

Immunologie und Infektion

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

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Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

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Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

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