Name: forward genetic approaches in chlamydia trachomatis
Uploaded: 2013-10-23T18:30:00
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1。化学変異注意：我々は、複製RBフォームはEBフォームより化学的突然変異誘発をより従順であることがわかった。半ばサイクル（HPI 20から18の間）で、RBは、事前RB-EB遷移の最大の数字である。 クラミジアは偏性細胞内の病原体であるため、ホストの健全性に対する変異の効果は、細菌の回復を制限することができます。ベロ細胞は、試験した他の細胞株に比べEMS?...

<ol>
	<li>Haggerty, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+sequelae+after+Chlamydia+trachomatis+genital+infection+in+women.">Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women.</a> J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).</li><li>Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+mechanisms+of+Chlamydia+entry.">Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry.</a> Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).</li><li>Hybiske, K., Stephens, R. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydia+psittaci+genome,+a+comparative+analysis+of+intracellular+pathogens.">The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens.</a> PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).</li><li>Jeffrey, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+recent+clinical+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+loci+associated+with+tissue+tropism+and+regions+of+apparent+recombination.">Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination.</a> Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).</li><li>Gomes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Chlamydia+trachomatis+diversity+occurs+by+widespread+interstrain+recombination+involving+hotspots.">Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots.</a> Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).</li><li>DeMars, R., Weinfurter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+gene+transfer+in+Chlamydia+trachomatis+in+vitro,+mechanism+and+significance.">Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance.</a> J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).</li><li>Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+gene+transfer+in+vitro+in+the+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis.</a> J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).</li><li>Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches.">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li><li>Tipples, G., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+initial+characterization+of+a+series+of+Chlamydia+trachomatis+isolates+selected+for+hydroxyurea+resistance+by+a+stepwise+procedure.">Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure.</a> J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).</li><li>Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+trimethoprim-+and+sulphisoxazole-resistant+Chlamydia+trachomatis.">Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis.</a> Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).</li><li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Laboratory+Maintenance+of+Chlamydia+trachomatis.">Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).</li><li>Li, H., Ruan, J., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+short+DNA+sequencing+reads+and+calling+variants+using+mapping+quality+scores.">Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores.</a> Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+tetracycline+resistance+among+Chlamydia+spp.+in+vitro.">Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).</li><li>Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+by+UvrABC+excinuclease+is+a+step+in+the+path+to+mutagenesis+by+psoralen+crosslinks+in+Escherichia+coli.">Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis,+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).</li></ol>

それは遺伝子型と表現型の間のリンケージを確立するように、この方法論は、遺伝子解析のための基本的な要件を満たしています。重要なことに、これはしばしば、非モデル微生物における遺伝子機能の解析における律速段階である組換えDNA形質転換菌の遺伝子の挿入不活化のための従来の分子生物学のツールの助けを借りずに達成される。 一つの重要なステップは、?...

関連付けられていると、米国では年間推定280万生殖路感染症（疾病管理センター）の後遺症などの骨盤内炎症性疾患、子宮外妊娠、および不妊症（1）などのための絶対細胞内細菌のクラミジアトラコマチスアカウント 。 クラミジア属はユニークを持っている感染が、非複製素体（EB）と非感染性はなく複製網状体（RB）：2つの形式で構成される二相性発達サイクルで生理。感染endoctyotosis（2）続いて上皮細胞へのEBのアタッチメントから始まります。膜結合液胞は、インクルージョンと呼ばれる中では、EBをその後二分裂によって複製RB形、に分化する。半ばサイクルで、RBの遷移当時感染の新しいラウンドを開始するために、細胞外空間に放出されているEBを、ときに宿主細胞溶解する（3）。 クラミジアですこのような細菌の遺伝学のほとんどの研究の中心となっている標的遺伝子の交換、トランスポゾン、および形質導入ファージ、などの標準的な分子遺伝学的ツールを使用してルーチン操作に耐火、それは個々のクラミジア遺伝子が自然免疫の回避に寄与する程度は不明である、栄養買収、発達トランジション、または真核生物宿主（4）内の病原体の生存のために重要な他のプロセス。したがって、この病原体はその臨床的重要性にもかかわらず、不十分な特徴のままです。 クラミジア属のゲノム。次世代シーケンシング技術を用いて配列決定、複数の種と生物型に（5）（〜1 MB）比較的小さい。 WGSによって比較ゲノム解析クラミジア種の進化にユニークな洞察を提供しており、ヒトの（6-8）へとある程度彼らの適応は病原因子のポテンシャル関数（9、10）のようないくつかの情報を提供してきました。 T臨床分離株で表示される、彼の遺伝的多様性は、このような遺伝子の変異を容易に対して選択されていたので、おそらく、体系的にほとんどの病原因子の機能をマッピングするために必要な解像度を提供していません。自然淘汰から交絡影響を与えることなく、病原性のメジャー欠陥その定義されたアッセイと相まって変異誘発の遺伝子変化は、調査することができる突然変異のスペクトルを拡張することができます。化学変異原は、特に、それらがnull、条件、hypomorphic（機能低下）を生成することができますとして有用、とhypermorphic（関数のゲイン）対立遺伝子である。堅牢な次世代のゲノム配列決定技術の到来により、そのような変異を容易に識別してマッピングすることができる。このように、強いアソシエーションが前方に遺伝的アプローチの適用を可能にする、遺伝子または遺伝子経路の変異および共通の表現型の間で行うことができる。 臨床株のゲノム配列は、モザイクBを明らかにしたetweenの血清型と頻繁な組み換えの軌跡（11）。組換えの経験的証拠は、2つの異なる抗生物質耐性株の両方株（12,13）からの遺伝的寄与を有することが判明した二重耐性子孫組換えの選択の同時感染により実証した。したがって、同時感染設定で野生型と変異株の間で遺伝子交換は、化学的に誘発される突然変異の偏析が観察された表現型につながる影響を受けた遺伝子を特定することができます。 ここでは、化学的突然変異誘発、WGS、および感染細胞内のDNA交換（14）（ 図1）のためのシステムに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

クラミジアトラコマチス 、性病と眼感染症の病原体は、組換えDNAで不完全に起因する実験的な変革へのその扱いにくさに特徴のままです。我々はCで遺伝子解析を実行するためのアプローチを開発分子遺伝学的ツールの不足にもかかわらず、 トラコマティス 。我々の方法は、関係する：i）急速に明確な表現型と遺伝的に定義された変異体の包括的なライブラリを生成するために、化学的突然変異誘発し、ii）の全ゲノムシーケンシング（WGS）は、基礎となる遺伝的病変をマッピングすると、変異遺伝子（群）との間の関連を見つけると。共通の表現型; iii）の変異体および野生型細菌と哺乳動物細胞の同時感染を介した組換え株の生成。そこで、遺伝子型と表現型の間の因果関係を確立することができました。相関遺伝子型 - 表現型の関連百鬼夜行を確立するために、化学的に誘発される遺伝子変異とWGSのカップリングldは遺伝子解析に現在難病医学的に、環境に重要な微生物の大規模なリストに広く適用される。

突然変異原への曝露は、細菌の細胞死が原因おそらく、細菌を欠い現れる介在物につながる。一般的に、血清型LGV-L2は完全に48時間後に感染症の中で感染した細胞を溶解しますが、変異誘発物質による治療は&gt; 90 hまでこのサイクルを拡張することができます。介在物の約10％が回復すると予想される。我々の実験では、20 mg / mlのEMSで治療感染Vero細胞は、未処理のコントロールと比較して感?...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

の遺伝的操作<em&gt;Δku80</emの機能ゲノム解析のための&gt;株<em&gt;トキソプラズマ</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面<em&gt;トキソプラズマ</emIFN-γ依存性細胞自律イミュニティへの抵抗のための重要な&gt;遺伝子

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...