Name: quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish
Uploaded: 2013-09-12T16:45:00
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Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents du laboratoire Kim, Mark Nilan pour les soins du poisson zèbre et l&#39;entretien, le Dr Robert Wheeler pour des discussions utiles et le partage de données, et des subventions des NIH 3RO1GM087308-02S1 et 1P20RR024475-01A2 et le Maine agricoles et forestiers expérimenter la station (numéro de publication 3303) pour le financement.

Une. Soins poisson zèbre et d&#39;entretien <ol><li> Élevage: poisson zèbre adulte d&#39;apparition de masse comme décrit précédemment 13. Recueillir des embryons engendrés comme décrit précédemment 14. </li><li> La micro-injection (si désiré): micro-injection 1-4 poisson zèbre embryons au stade de cellules avec des oligonucléotides morpholino à knockdown produits géniques ou ARNm pour surexprimer produits géniques comme décrit précédemment 15. <ol><li> Maintenir un...

<ol>
	<li>Medzhitov, R., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity:+Impact+on+the+Adaptive+Immune+Response.">Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response.</a> Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Maturation+of+the+Immune+System+in+Zebrafish,+Danio+rerio:+A+Gene+expression+Profiling.">Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling.</a> In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).</li><li>Stockhammer, O. 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(NIH R01 RR15402).</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2001).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Release+Clones:+A+High+Throughput+Expression+Analysis.">Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis.</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Table+18.4.">Table 18.4.</a> The Molecular Probes Handbook. , .</li></ol>

La fonction principale des phagocytes est de détecter, engloutir, et détruire les agents pathogènes. La capacité des phagocytes pour produire une explosion respiratoire adéquate est essentielle pour cette fonction. Ainsi, la quantification de la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif est une méthode pour permettre la comparaison de la santé générale immunitaire innée et la fonction entre des groupes d&#39;individus et / ou en réponse à des manipulations expérimentales. Ici, nous décrivons un prot...

Le système immunitaire comprend deux branches: l&#39;immunité innée et adaptative. L&#39;immunité innée est évolutif plus ancienne que l&#39;immunité adaptative. Invertébrés sont actuellement pensé pour avoir seulement l&#39;immunité innée, alors que les vertébrés possèdent deux branches innées et adaptatives. Alors que l&#39;immunité adaptative confère une immunité spécifique et de longue durée à certains agents pathogènes, l&#39;immunité innée est une réponse immédiate aux bactéries envahissantes, les virus et les champignons. Un aspect crucial de la réponse immunitaire innée implique la libération de cytokines et de chimiokines, ce qui entraîne l&#39;inflammation et le recrutement des phagocytes (par exemple, les macrophages, les neutrophiles) d&#39;engloutir et de détruire les envahisseurs étrangers. Réponses immunitaires innées qui réussissent comprennent: (1) la reconnaissance des micro-organismes envahisseurs; (2) l&#39;induction des cascades de signalisation appropriées (par exemple de libération de cytokines et de chimiokines), (3) le développement approprié / un nombre suffisant de cellules phagocytaires; (4) Migration des phagocytes vers les sites d&#39;infection; (5) l&#39;engloutissement des agents pathogènes, et (6) la destruction des micro-organismes englouti. Une carence dans l&#39;une quelconque de ces étapes pourrait conduire à l&#39;hôte d&#39;être submergé par, et de succomber à, l&#39;infection. Une réponse immunitaire innée robuste est essentiel à la santé des organismes, car elle est la première ligne de défense contre les agents pathogènes dans les plantes et les animaux. Chez les vertébrés, il potentialise également la réponse immunitaire adaptative 1. Par conséquent, il est essentiel que nous sommes en mesure d&#39;évaluer tous les aspects de la réponse immunitaire innée afin de mieux comprendre et d&#39;optimiser sa fonction. De nombreux organismes modèles sont utilisés pour étudier l&#39;immunité innée, allant de Arabadopsis à C. elegans à la drosophile à des souris à des cellules humaines en culture. Un avantage d&#39;utiliser le poisson zèbre (Danio rerio) du système modèle pour étudier l&#39;immunité innée, c&#39;est que le poisson zèbre est un vertébré, avec im innée et acquisecommunauté, mais le développement de l&#39;immunité innée et adaptative sont temporairement séparés. Poisson zèbre se fonder uniquement sur ​​l&#39;immunité innée pour la protection contre l&#39;infection jusqu&#39;à ce que l&#39;immunité adaptative devient entièrement fonctionnel, qui se produit autour de 4-6 semaines après la fécondation 2. En plus des outils pour la manipulation génétique, la clarté optique et développement externe rapide, l&#39;immunité innée comme le principal mode de défense dans embryons de poissons zèbres fournit un modèle simplifié dans lequel pour étudier la complexité de la réponse immunitaire innée in vivo. Plusieurs protocoles ont été élaborés pour évaluer différentes facettes de la réponse immunitaire innée chez les embryons de poisson zèbre. Les puces à ADN ont validé RNAseq et que les profils de cytokines induites par la réponse immunitaire innée poisson zèbre sont similaires à celui des humains et ont également suggéré l&#39;implication de gènes inattendus dans l&#39;immunité innée 3,4. La transparence de l&#39;embryon de poisson zèbre et fluorescent, transgenic souches d&#39;agents pathogènes et de poisson zèbre pour permettre la visualisation des interactions hôte-pathogène dynamiques in vivo en temps réel. Embryons de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur spécifique de la myéloperoxydase des neutrophiles ou la 5,6-spécifique des macrophages MPEG1 promoteur 7 ont permis de visualiser et de quantifier la migration des phagocytes à des sites d&#39;infections localisées 8 ainsi que de visualiser la phagocytose et la destruction de marqué par fluorescence pathogènes 8,9. Embryons de poisson zèbre sont également prêtent à la génération de tests à haut débit et les écrans chimiques. En conséquence, les méthodes d&#39;analyse du transcriptome lors de l&#39;infection 10 et migration des phagocytes à des sites de lésion induite chimiquement 11 à haut débit ont récemment été mis au point. Des techniques énumérées ci-dessus, aucun d&#39;évaluer quantitativement l&#39;étape finale de destruction d&#39;agents pathogènes par les phagocytes. Cette dernière étapeimplique une salve respiratoire (c.-à-production de ROS et d&#39;autres composés toxiques), qui tuent les agents pathogènes englouti. L&#39;enzyme oxydase NADPH est une source majeure de ROS dans les cellules phagocytaires. L&#39;assemblage des sous-unités des résultats d&#39;enzyme NADPH oxydase dans le transfert d&#39;électrons de l&#39;oxygène, générer des anions superoxydes. Par des réactions enzymatiques suivantes, superoxyde peut ensuite être converti en peroxyde d&#39;hydrogène et l&#39;acide hypochloreux (Figure 1A). Il s&#39;agit de la stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes qui tue les pathogènes, et donc, la quantification du potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre est indicative de la santé globale immunitaire innée. Nous avons développé un test basé sur la fluorescence pour quantifier la salve respiratoire par groupes de 12 embryons de poisson zèbre individuels. Ce test utilise la forme non fluorescente, la réduction d&#39;un colorant disponible dans le commerce, la cellule-perméable. Ce colorant, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluoresceine diacétate (H2DCFDA), est converti en la fluorescencecomposé de cent, 2 &#39;, 7&#39;-fluorescéine (DCF), lors de l&#39;oxydation. Les diverses ROS générés par l&#39;éclatement respiratoire des phagocytes peuvent oxyder H2DCFDA et générer une fluorescence 24. L&#39;apparition de fluorescence peut être utilisée pour quantifier et comparer la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes de poisson-zèbre. L&#39;agoniste de l&#39;acétate myristate de phorbol protéine kinase C (PMA) est utilisé pour induire chimiquement la NADPH oxydase pour produire des ROS et d&#39;augmenter ainsi des lectures de fluorescence (Figure 1B). Ici, nous fournissons un protocole détaillé d&#39;une version modifiée et optimisée de ce dosage embryon de poisson zèbre stimulation du métabolisme oxydatif. Ce dosage peut être utilisé pour comparer la stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes d&#39;embryons de poisson zèbre individuels au cours du temps et / ou en réponse à des manipulations expérimentales (par exemple morpholino knockdown médié par la protéine). L&#39;utilisation de cette méthode, en conjonction avec d&#39;autres tests de l&#39;immunité innée de poisson zèbre, fournira une image plus complète du complexe et critiqueréponse immunitaire innée.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

La stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes fait partie de la réponse immunitaire innée à l&#39;infection par des agents pathogènes et implique la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS). ROS sont toxiques et fonctionne pour tuer les microorganismes phagocytées. Dans quantification in vivo de phagocyte dérivés ROS fournit des informations sur la capacité de l&#39;organisme à une réponse immunitaire innée robuste. Ici, nous décrivons un protocole pour quantifier et comparer ROS dans embryons de poissons zèbres entiers lors de l&#39;induction chimique de l&#39;explosion respiratoire phagocytaire. Ce procédé fait usage d&#39;un composé non fluorescent qui devient fluorescent lors de l&#39;oxydation par les ROS. Embryons de poisson zèbre individuels sont déposés à la pipette dans les puits d&#39;une microplaque et on les incube dans ce substrat fluorogène avec ou sans un inducteur chimique de la stimulation du métabolisme oxydatif. La fluorescence dans chaque puits est quantifiée à des points temporels souhaités en utilisant un lecteur de microplaque. Des lectures de fluorescence sont ajustés pour éliminer la fluorescence de fond et compared l&#39;aide d&#39;un test t non apparié. Cette méthode permet de comparer le potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre à différents stades de développement et en réponse à des manipulations expérimentales telles que la protéine effet de choc, la surexpression, ou un traitement avec des agents pharmacologiques. Ce procédé peut également être utilisé pour surveiller la réponse de la stimulation du métabolisme oxydatif dans les reins disséqué entières ou des préparations de cellules de reins de poisson zèbre adulte et une autre espèce de poisson. Nous croyons que la relative simplicité et l&#39;adaptabilité de ce protocole complètent les protocoles existants et seront d&#39;intérêt pour les chercheurs qui cherchent à mieux comprendre la réponse immunitaire innée.

Ici, nous fournissons des données comparant la réponse à l&#39;éclatement respiratoire dans embryons de poissons zèbres (de type sauvage, AB fond) à 48 et 72 heures après la fécondation (HPF). Les 48 embryons de HPF agi comme notre groupe de contrôle et les 72 HPF embryons que notre groupe expérimental. La taille de l&#39;échantillon utilisé était de 24 embryons induite Nations unies et les 24 embryons PMA-induites par stade de développement. Lectures de fluorescence brutes (en unités relatives de fluores...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

La réponse immunitaire innée protège contre l&#39;infection par des organismes pathogènes. Un élément essentiel de la réponse immunitaire innée, l&#39;explosion respiratoire des phagocytes, génère des espèces réactives de l&#39;oxygène qui tuent les micro-organismes envahisseurs. Nous décrivons un essai de stimulation du métabolisme oxydatif qui quantifie les espèces réactives de l&#39;oxygène produites lors de la réponse immunitaire innée est chimiquement induite.

Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d&#39;Innate Immune Health chez le poisson zèbre

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

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A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...