Name: quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish
Uploaded: 2013-09-12T16:45:00
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Os autores gostariam de agradecer os membros antigos e atuais do laboratório de Kim, Mark Nilan para o cuidado e manutenção do peixe-zebra, o Dr. Robert Wheeler para discussões úteis e compartilhamento de dados, e NIH concede 3RO1GM087308-02S1 e 1P20RR024475-01A2 eo Agrícolas e Florestais Maine Experiment Station (Publicação Número 3303) para financiamento.

1. Cuidados e Manutenção Zebrafish <ol><li> Pecuária: desova Mass adulto zebrafish como descrito anteriormente 13. Recolhe embriões gerados como anteriormente descrito 14. </li><li> Microinjecção (se for o caso): Microinject 1-4 estágio de células de embriões de peixes-zebra com oligonucleótidos morfolino para knockdown produtos do gene ou ARNm para sobre-expressar os produtos dos genes, como previamente descrito 15. <ol><li> Manter uma piscina adequada de falsa controles inj...

<ol>
	<li>Medzhitov, R., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity:+Impact+on+the+Adaptive+Immune+Response.">Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response.</a> Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Maturation+of+the+Immune+System+in+Zebrafish,+Danio+rerio:+A+Gene+expression+Profiling.">Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling.</a> In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).</li><li>Stockhammer, O. 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(NIH R01 RR15402).</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2001).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Release+Clones:+A+High+Throughput+Expression+Analysis.">Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis.</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Table+18.4.">Table 18.4.</a> The Molecular Probes Handbook. , .</li></ol>

A principal função dos fagócitos é detectar, engolfar e destruir patógenos. A capacidade dos fagócitos para produzir uma explosão respiratória adequado é crítico para esta função. Assim, a quantificação da resposta explosão respiratória é um método para permitir a comparação de saúde imune inato geral e função entre grupos de indivíduos e / ou em resposta a manipulações experimentais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para induzir, quantificar e comparar a resposta explosão respiratória ent...

O sistema imunitário é constituído por duas ramificações: a imunidade inata e adaptativa. A imunidade inata é evolutivamente mais antiga do que a imunidade adaptativa. Invertebrados são atualmente pensado para ter só a imunidade inata, enquanto os vertebrados possuem ambos os ramos inata e adaptativa. Enquanto a imunidade adaptativa confere imunidade específica e de longa duração a certos patógenos, a imunidade inata é uma resposta imediata às bactérias invasoras, vírus e fungos. Um aspecto importante da resposta imune inata envolve a libertação de citocinas e quimiocinas, o que resulta em inflamação e recrutamento de fagócitos (por exemplo, macrófagos, neutrófilos) para engolir e destruir invasores estranhos. Respostas imune inata de sucesso envolvem: (1) o reconhecimento de microorganismos invasores, (2) indução das cascatas de sinalização adequadas (por exemplo, liberação de citocinas e quimiocinas), (3) desenvolvimento adequado / número adequado de células fagocíticas, (4) Migração de fagócitos para locais de infecção; (5) imersão de patógenos, e (6) a destruição de microorganismos engoliram. Uma deficiência em qualquer uma dessas etapas pode levar ao host que está sendo oprimido por e sucumbir a, a infecção. Uma resposta imune inata robusta é vital para a saúde dos organismos, porque é a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos, em todas as plantas e animais. Nos vertebrados, também potencia a resposta imune adaptativa 1. Portanto, é fundamental que nós somos capazes de avaliar todos os aspectos da resposta imune inata, a fim de entendê-lo melhor e para optimizar a sua função. Muitos organismos modelo são usados ​​para estudar a imunidade inata, que vão desde a Arabadopsis C. elegans, Drosophila a ratos para as células humanas em cultura. Uma vantagem de se utilizar o peixe-zebra (Danio rerio) sistema modelo para o estudo da imunidade inata é que o peixe-zebra é um vertebrado, com tanto inata e adaptativa imdade, mas o desenvolvimento da imunidade inata e adaptativa são temporalmente segregados. Zebrafish dependa exclusivamente de imunidade inata para a proteção contra a infecção até que a imunidade adaptativa torna-se totalmente funcional, que ocorre cerca de 4-6 semanas após a fertilização 2. Além de ferramentas para a manipulação genética, a claridade óptica e rápido desenvolvimento, externa, a imunidade inata como o modo de princípio de defesa em embriões de peixe-zebra fornece um modelo simplificado para se estudar a complexidade da resposta imune inata in vivo. Vários protocolos têm sido desenvolvidas para avaliar diferentes facetas da resposta imune inata em embriões de peixe-zebra. Microarrays e RNAseq validaram que os perfis de citoquinas induzidas pela resposta imune inata do peixe-zebra são semelhantes aos de humanos e têm também sugerido o envolvimento de genes inesperados na imunidade inata 3,4. A transparência do embrião de peixe-zebra e fluorescente, transgénicacepas ic de patógenos e zebrafish permitir a visualização de interações patógeno-hospedeiro dinâmicos in vivo em tempo real. Embriões de peixes-zebra transgénicos que expressam a GFP sob o controlo do promotor específico de mieloperoxidase de neutrófilos 5,6 ou o MPEG1 promotor específico de macrófago 7 tornaram possível visualizar e quantificar a migração dos fagócitos para os locais de infecções localizadas 8, bem como para visualizar a fagocitose e destruição de marcada com fluorescência patógenos 8,9. Embriões de peixes-zebra também são susceptíveis à geração de ensaios de alto rendimento e telas químicos. Por conseguinte, recentemente, têm sido desenvolvidos métodos de alto rendimento de análise do transcriptoma por infecção 10 e fagócitos migração para os locais de lesão induzida quimicamente 11. Das técnicas listadas acima, nenhum avaliar quantitativamente a fase final de destruição patógeno pelos fagócitos. Esta fase finalenvolve uma explosão respiratória (ou seja, produção de ROS e outros compostos tóxicos), que matam os patógenos engoliram. A enzima NADPH-oxidase é uma importante fonte de ROS nas células fagocíticas. Montagem das subunidades dos resultados da enzima NADPH-oxidase de transferência de electrões para o oxigénio, a geração de superóxido. Por meio de reacções enzimáticas subsequentes, superóxido pode então ser convertido em peróxido de hidrogénio e ácido hipocloroso (Figura 1A). É o colapso respiratório de fagócitos que mata organismos patogénicos e assim, a quantificação do potencial de explosão respiratória de embriões de peixes-zebra é indicativo de saúde global imune inata. Foi desenvolvido um ensaio baseado em fluorescência para quantificar a explosão respiratória em grupos de embriões de peixes-zebra individuais 12. Este ensaio utiliza a forma não-fluorescente, reduzida de um corante disponível comercialmente, de células-permeável. Este corante, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), é convertido para o fluocomposto cento, 2 &#39;, 7&#39;-diclorofluoresceína (DCF), por oxidação. As diversas ROS geradas pela explosão respiratória dos fagócitos podem oxidar H2DCFDA e gerar fluorescência 24. O aparecimento de fluorescência pode ser utilizado para quantificar e comparar a resposta de explosão respiratória entre grupos de peixe-zebra. A proteína quinase C de etilo agonista de miristato de forbol (PMA) é utilizado para induzir quimicamente NADPH-oxidase para a produção de ROS e, assim, aumentar as leituras de fluorescência (Figura 1B). Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado de uma versão modificada e optimizada deste ensaio explosão respiratória embrião do peixe-zebra. Este ensaio pode ser utilizado para comparar a explosão respiratória entre grupos de embriões de peixes-zebra individuais ao longo do tempo e / ou em resposta a manipulações experimentais (por exemplo, proteína de knockdown morfolino-mediada). O uso deste método, em conjunto com outros ensaios de imunidade inata peixe-zebra, irá fornecer uma imagem mais completa do complexo e críticoresposta imune inata.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

A explosão respiratória dos fagócitos é parte da resposta imune inata à infecção e envolve a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS são tóxicos e funcionar para matar microorganismos fagocitados. In vivo quantificação de derivados de fagócitos ROS fornece informações sobre a capacidade de um organismo para montar uma resposta imune inata robusto. Aqui nós descrevemos um protocolo para quantificar e comparar ROS em embriões de peixe-zebra inteiros após indução química da explosão respiratória dos fagócitos. Este método faz com que a utilização de um composto não fluorescente que se torna fluorescente por oxidação por ROS. Embriões de peixes-zebra individuais são pipetadas para os poços de uma microplaca e incubadas neste substrato fluorogénico com ou sem um indutor químico da explosão respiratória. Fluorescência em cada poço é quantificada em momentos desejados utilizando um leitor de microplacas. As leituras de fluorescência são ajustados para eliminar a fluorescência de fundo e, em seguida, compared usando um teste t não pareado. Este método permite a comparação do potencial de explosão respiratória de embriões de peixes-zebra, em diferentes estágios de desenvolvimento e em resposta a manipulações experimentais, tais como o knockdown da proteína, a sobre-expressão, ou a tratamento com agentes farmacológicos. Este método também pode ser utilizado para monitorar a resposta a explosão respiratória em rins dissecados inteiros ou preparações de células de rins de peixe-zebra adultos e algumas outras espécies de peixe. Acreditamos que a relativa simplicidade e capacidade de adaptação deste protocolo irá complementar os protocolos existentes e será de interesse para os pesquisadores que procuram entender melhor a resposta imune inata.

Aqui, nós fornecemos dados comparando a resposta explosão respiratória em embriões de peixe-zebra (tipo selvagem, AB de fundo) em 48 e 72 horas pós fertilização (hpf). Os 48 embriões HPF atuou como nosso grupo controle e os 72 hpf embriões como nosso grupo experimental. O tamanho da amostra utilizada foi de 24 embriões induzida por un e 24 embriões induzidas PMA por estágio de desenvolvimento. Leituras de fluorescência em bruto (em unidades de fluorescência relativas (RFU)) foram obtidas através da leitur...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

A resposta imune inata protege os organismos contra uma infecção patogénica. Um componente crítico da resposta imune inata, a explosão respiratória de fagócitos, gera espécies reativas de oxigênio, que matam microorganismos invasores. Nós descrevemos um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas quando a resposta imune inata é induzida quimicamente.

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

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Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...