Name: quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish
Uploaded: 2013-09-12T16:45:00
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Los autores desean agradecer a los miembros anteriores y actuales del laboratorio de Kim, Mark Nilan para el cuidado de pez cebra y el mantenimiento, el Dr. Robert Wheeler útil para los debates y el intercambio de datos, y las subvenciones del NIH 3RO1GM087308-02S1 y 1P20RR024475-01A2 y el Maine Agrícolas y Forestales Estación Experimental (Publicación 3303) para su financiación.

1. Cuidado y mantenimiento de pez cebra <ol><li> Ganadería: spawn Misa adultos de pez cebra como se ha descrito previamente 13. Recoger los embriones generados como se ha descrito previamente 14. </li><li> La microinyección (si se desea): microinject 1-4 etapa de célula embriones de pez cebra con oligonucleótidos de morfolino a desmontables productos de genes o de ARNm para sobreexpresar productos de genes como se ha descrito previamente 15. <ol><li> Mantener un número adecuado de...

<ol>
	<li>Medzhitov, R., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity:+Impact+on+the+Adaptive+Immune+Response.">Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response.</a> Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Maturation+of+the+Immune+System+in+Zebrafish,+Danio+rerio:+A+Gene+expression+Profiling.">Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling.</a> In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).</li><li>Stockhammer, O. 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(NIH R01 RR15402).</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2001).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Release+Clones:+A+High+Throughput+Expression+Analysis.">Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis.</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Table+18.4.">Table 18.4.</a> The Molecular Probes Handbook. , .</li></ol>

La función primaria de los fagocitos es detectar, engullir, y destruir patógenos. La capacidad de los fagocitos para producir una explosión respiratoria adecuada es crítica para esta función. Por lo tanto, la cuantificación de la respuesta de la explosión respiratoria es un método para permitir la comparación de la salud inmune innata y las funciones generales entre los grupos de personas y / o en respuesta a manipulaciones experimentales. Aquí se describe un protocolo para inducir, cuantificar y comparar la r...

El sistema inmune está compuesto por dos ramas: la inmunidad innata y adaptativa. La inmunidad innata es evolutivamente más antigua que la inmunidad adaptativa. Los invertebrados se cree actualmente que sólo tienen inmunidad innata, mientras que los vertebrados poseen tanto las ramas innata y adaptativa. Mientras que la inmunidad adaptativa confiere inmunidad específica y duradera a ciertos agentes patógenos, la inmunidad innata es una respuesta inmediata a las bacterias invasoras, virus y hongos. Un aspecto crucial de la respuesta inmune innata implica la liberación de citocinas y quimiocinas, lo que resulta en la inflamación y el reclutamiento de fagocitos (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos) para engullir y destruir los invasores extraños. La respuesta inmune innata exitosos involucran: (1) el reconocimiento de microorganismos invasores; (2) la inducción de las cascadas de señalización apropiados (por ejemplo, liberación de citocinas y quimiocinas); (3) de desarrollo adecuado / números adecuados de células fagocíticas; (4) La migración de los fagocitos a sitios de infección; (5) inmersión de patógenos, y (6) la destrucción de microorganismos envueltos. Una deficiencia en cualquiera de estos pasos podría dar lugar al huésped que está siendo abrumado por, y sucumbir a la infección. Una respuesta inmune innata robusta es vital para la salud de los organismos, ya que es la primera línea de defensa contra los patógenos en todas las plantas y animales. En los vertebrados, sino que también potencia la respuesta inmune adaptativa 1. Por lo tanto, es fundamental que seamos capaces de evaluar todos los aspectos de la respuesta inmune innata, a fin de comprender mejor y optimizar su función. Muchos organismos modelo se utilizan para estudiar la inmunidad innata, que van desde Arabidopsis a C. elegans a Drosophila a ratones a células humanas cultivadas. Una ventaja de utilizar el pez cebra (Danio rerio) sistema modelo para estudiar la inmunidad innata es que el pez cebra es un vertebrado, con im tanto innata y adaptativadad, sin embargo, el desarrollo de la inmunidad innata y adaptativa están temporalmente separados. El pez cebra se basan únicamente en la inmunidad innata para la protección contra la infección hasta que la inmunidad adaptativa sea plenamente funcional, que produce alrededor de 4-6 semanas después de la fecundación 2. Además de las herramientas para la manipulación genética, la claridad óptica y rápido desarrollo, externa, la inmunidad innata como el modo de principio de defensa en embriones de pez cebra ofrece un modelo simplificado en el que para estudiar la complejidad de la respuesta inmune innata en vivo. Múltiples protocolos han sido desarrollados para evaluar las diferentes facetas de la respuesta inmune innata en embriones de pez cebra. Microarrays y RNAseq han validado que los perfiles de citoquinas producidas por la respuesta inmune innata de pez cebra son similares a la de los seres humanos y también han sugerido la implicación de los genes inesperados en la inmunidad innata 3,4. La transparencia del embrión de pez cebra y fluorescente, transgenic cepas de patógenos y pez cebra permiten la visualización de las interacciones huésped-patógeno dinámicas in vivo en tiempo real. Embriones de pez cebra transgénicos que expresan GFP bajo el control del promotor de la mieloperoxidasa de neutrófilos-específica 5,6 o el promotor específico de macrófagos MPEG1 7 han hecho posible para visualizar y cuantificar la migración de fagocitos a los sitios de infecciones localizadas 8, así como para visualizar la fagocitosis y la destrucción de marcado con fluorescencia patógenos 8,9. Embriones de pez cebra también son susceptibles a la generación de ensayos de alto rendimiento y pantallas químicos. En consecuencia, recientemente se han desarrollado métodos de alto rendimiento de análisis del transcriptoma después de la infección 10 y fagocitos migración a los sitios de lesión inducida químicamente 11. De las técnicas mencionadas anteriormente, ninguno evaluar cuantitativamente la etapa final de la destrucción de patógenos por los fagocitos. Esta etapa finalimplica un estallido respiratorio (es decir, la producción de ROS y otros compuestos tóxicos), que mata a los patógenos envueltos. La enzima NADPH oxidasa es una fuente importante de ROS en células fagocíticas. Asamblea de las subunidades de la NADPH oxidasa resultados de la enzima en la transferencia de electrones al oxígeno, la generación de aniones superóxido. A través de reacciones enzimáticas posteriores, superóxido a continuación, puede ser convertido en peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso (Figura 1A). Es la explosión respiratoria de los fagocitos que mata a los patógenos y, por tanto, la cuantificación de la potencial explosión respiratoria de los embriones de pez cebra es indicativo de la salud inmune innato general. Hemos desarrollado un ensayo basado en la fluorescencia para cuantificar el estallido respiratorio en grupos de embriones de pez cebra individuales 12. Este ensayo utiliza la no fluorescente, forma reducida de un colorante permeable a las células disponibles comercialmente. Este colorante, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), se convierte en el fluorescentecompuesto ciento, 2 &#39;, 7&#39;-diclorofluoresceína (DCF), tras la oxidación. Los diversos ROS generados por el estallido respiratorio de fagocitos pueden oxidar H2DCFDA y generar fluorescencia 24. La aparición de la fluorescencia se puede utilizar para cuantificar y comparar la respuesta de estallido respiratorio entre los grupos de pez cebra. El acetato de miristato de forbol agonista de la proteína quinasa C (PMA) se utiliza para inducir químicamente NADPH oxidasa para producir ROS y por lo tanto aumentar lecturas de fluorescencia (Figura 1B). Aquí, ofrecemos un protocolo detallado de una versión modificada y optimizada de este embrión ensayo estallido respiratorio de pez cebra. Este ensayo se puede usar para comparar el estallido respiratorio entre los grupos de embriones de pez cebra individuales en el tiempo y / o en respuesta a las manipulaciones experimentales (por ejemplo, morfolino mediada desmontables de proteínas). El uso de este método, en conjunción con otros ensayos de inmunidad innata de pez cebra, proporcionará una imagen más completa de la compleja y críticarespuesta inmune innata.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

La explosión respiratoria de los fagocitos es parte de la respuesta inmune innata a la infección por patógenos e implica la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). ROS son tóxicos y funciona para matar los microorganismos fagocitadas. En la cuantificación in vivo de fagocito-ROS derivados proporciona información con respecto a la capacidad de un organismo para montar una respuesta inmune innata robusta. Aquí se describe un protocolo para cuantificar y comparar ROS en embriones de pez cebra enteros tras la inducción química de la explosión respiratoria de los fagocitos. Este método hace uso de un compuesto no fluorescente que se vuelve fluorescente tras la oxidación por ROS. Individuales embriones de pez cebra se pipetean en los pocillos de una microplaca y se incubaron en este sustrato fluorogénico con o sin un inductor químico de la explosión respiratoria. La fluorescencia en cada pocillo se cuantifica en puntos de tiempo deseado utilizando un lector de microplacas. Las lecturas de fluorescencia se ajustan para eliminar la fluorescencia de fondo y después se compared usando una prueba t no pareada. Este método permite la comparación del potencial de explosión respiratoria de los embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo y en respuesta a manipulaciones experimentales tales como la precipitación de proteínas, la sobreexpresión, o tratamiento con agentes farmacológicos. Este método también puede ser usado para monitorear la respuesta de estallido respiratorio en los riñones disecados enteras o preparaciones de células de riñones de adultos de pez cebra y algunas otras especies de peces. Creemos que la relativa simplicidad y adaptabilidad de este protocolo se complementan los protocolos existentes y serán de interés para los investigadores que buscan comprender mejor la respuesta inmune innata.

Aquí, ofrecemos datos que comparan la respuesta estallido respiratorio en los embriones de pez cebra (de tipo silvestre, AB fondo) a 48 y 72 horas después de la fecundación (HPF). Los 48 embriones HPF actuado como nuestro grupo de control y los 72 HPF embriones como nuestro grupo experimental. El tamaño de la muestra utilizada fue de 24 embriones inducidos por la ONU-y 24 embriones PMA inducida por la etapa de desarrollo. Las lecturas de fluorescencia en bruto (en unidades de fluorescencia relativa (RFU)) se obtuvie...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

La respuesta inmune innata protege a los organismos contra la infección por patógenos. Un componente fundamental de la respuesta inmune innata, el estallido respiratorio de fagocitos, genera especies reactivas del oxígeno que matan los microorganismos invasores. Se describe un ensayo de estallido respiratorio que cuantifica las especies reactivas del oxígeno producido cuando la respuesta inmune innata es inducida químicamente.

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Investigación

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Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

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Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

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