Name: a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

LMW en RHK worden ondersteund door Graduate School of Biomedical Science and Engineering (GSBSE) UMaine&#39;s; RHK werd ook gesteund door de Maine Landbouw &amp; Forest Experiment Station. Aanvullende financiering werd verstrekt door het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen (NIH P20-GM103423), de Maine Landbouw &amp; Forest Experiment Station (Grant Number ME08004-10, JAG), de Universiteit van Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) , en een onderzoek Starter Grant in Farmacologie / Toxicologie van de PhRMA foundation (JAG). Wij danken Drs. David Holowka en Barbara Baird voor het antigeen en cellen. We zijn dankbaar voor Hina Hashmi, Alejandro Velez en Andrew Abovian voor hulp met apparatuur en orders. Dit is Maine Landbouw &amp; Forest Experiment Station publicatienummer 3311.

Merk op dat alle buffer recepten in een tabel aan het eind van het protocol tekst. DAG 1: 1. Bereiding van Cellen <ol><li> Plan uit 96-well plaat setup regeling, centreren proefmonsters op de lay-out, om randeffecten te vermijden. Allocate triplo voor elke geteste concentratie TCS (± degranulatie stimulerende antigeen of ionofoor), alsmede drievoud voor spontane afgifte (geen degranulatie stimulerend), maximale afgifte (0,2% Triton X-100 [TX] deter...

In 2004, Naal et al.. 1 ontwikkelde een mestcel biosensor voor high-throughput testen van degranulatie. Het is een robuuste test die we hebben aangepast voor onze TCS studies en beschreven in deze video. Voorafgaand aan de Naal et al.. 1 assay mastceldegranulering waren routinematig beoordeeld via β-hexosaminidase 59-61, maar deze vroege methoden gebruikt fluorometers waarbij een monster tegelijk lezen. Belangrijk Naal et al.. gevestigde directe concordantie tussen hun meer high-t...

Mestcellen zeer kristalsuiker immuuneffectorcellen die dienen als belangrijke bemiddelaars bij astma, allergieën, parasieten defensie en carcinogenese 13-16. Zij verblijven in bijna elk gevasculariseerd weefsel 15, waar ze veilig allergische en inflammatoire mediatoren slaan in cytoplasmatische korrels totdat geactiveerd om degranuleren. Degranulatie is de exocytose van membraan-gebonden korrels, waardoor de afgifte van farmacologisch werkzame mediatoren zoals histamine, tryptase en leukotriënen 15. Dit proces resulteert in de opening van type I overgevoeligheidsreacties die kritisch montage verdediging tegen parasieten als inleiding allergische, astmatische en carcinogeen reacties 15. Mestcellen en basofielen expressie FcsRI receptoren, de hoge affiniteit receptoren voor immunoglobuline E (IgE) 17. Blootstelling aan een allergeen of antigen veroorzaakt aggregatie van meerdere IgE-receptoren gebonden FcsRI 17, en het is deze so zogenaamde &quot;crosslinking&quot; of IgE gebonden Fc receptoren die de degranulatie initieert: een cascade van tyrosine fosforylatie gebeurtenissen, de activering van fosfolipase C, efflux van calcium uit interne opslag en instroom van calcium in de cel 18. Dit calcium influx is noodzakelijk voor degranulatie en voorts signalen granule fusie met het membraan voor het veroorzaken granule exocytose 15. Experimenteel kan een calciumionofoor worden gebruikt shuttle calcium direct over het celmembraan 19, dat in wezen alle omzeilt signaaltransductie stappen vóór de calcium influx stap 20, voor de identificatie van een route doel door een giftige stof als stroomopwaarts of stroomafwaarts van calcium signalering 20. Degranulatie kan snel en effectief worden gemeten door het volgen van het vrijkomen van β-hexosaminidase in cel supernatant, die lineair vrijkomt uit de granules samen met histamine 6, maar iis veel gemakkelijker te detecteren met behulp van een eenvoudige enzym-substraat reactie en een microplaat lezer assay het fluorescerende product. Dit microplaat test, zoals beschreven in de paragraaf protocol is gebaseerd op een robuuste methode oorspronkelijk ontwikkeld door Naal et al.. 1, waarbij de splitsing van het fluorogene substraat 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide kwantificeert door β- hexosaminidase. We hebben de test aangepast om te testen effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen, met triclosan gemarkeerd hier. Deze methode betrouwbaar kwantificeert degranulatie, is een goedkoop alternatief voor bijvoorbeeld flowcytometrische gebaseerde detectiemethoden 21, en ​​heeft de potentie om zich goed lenen voor high-throughput screening van een groot aantal anti-allergische geneesmiddelen, alsmede immuno of allergene stoffen. Dit laatste punt is bijzonder belangrijk in het licht van de 2007 National Research Council rapport &quot;Onderzoek naar de toxiciteit in de 21e eeuw: Een visie en een Stratgie &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), die pleit voor de ontwikkeling van high-throughput toxicologische tests die celcultuur gebruiken om het kostbare gebruik van traditionele proefdieren zoals muizen te verminderen. De degranulatie protocol ontwikkeld door Naal et al.. 1 en gewijzigd door ons 2, maakt gebruik van de RBL-2H3 cellijn, die een goed geaccepteerd model homoloog aan menselijke mucosale mestcellen of basofielen 3-5. (Werkwijzen voor het kweken van RBL-2H3 cellen zijn beschreven in Hutchinson et al.. 22). Deze test kan waarschijnlijk worden aangepast aan elke aangesloten mast celtype. Triclosan (TCS) is een breed-spectrum antimicrobiële die is gebruikt voor meer dan 30 jaar in ziekenhuizen, producten voor persoonlijke verzorging, en consumptiegoederen 23,24. De werkingswijze van antimicrobiële eigenschap TCS is de remming van vetzuur-biosynthese, waarschijnlijk door remming enoyl-acyldragereiwit reductase 25,26. Het is wereldwijd te vinden in een breed scala van consumentenproducten, zoals douchegel, handcrème, tandpasta, mondwater, en in de hand zepen bij concentraties tot 0,3% of 10 mM 24. Wijdverbreide gebruik van TCS heeft geresulteerd in detecteerbare niveaus in mensen 27-29 en in rivieren en beken 30. Een studie uitgevoerd door Allmyr et al.. 27 aangetoond dat TCS en zijn metabolieten aanwezig in zowel het plasma en melk van zogende moeders zijn. Belangrijker is TCS gemakkelijk geabsorbeerd in de huid 31-37. Queckenberg et al.. Gevonden 37 ~ 10% opname van een ~ 70 mM TCS room in menselijke huid binnen 12 uur, met een aanzienlijke concentratie in de huid, waar de mast cellen verblijven. TCS is klinisch aangetoond dat de mens allergische huidziekte 7-11 beheren, maar het mechanisme waardoor TCS verlicht allergische huidziekten is onbekend 38 geweest. Met behulp van de fluorescerende microplate assay detailed in deze video, we onlangs aangetoond dat TCS, bij concentraties zo laag als 2 pM aanzienlijk gedempt mestcel functie en degranulatie, die een mogelijke verklaring voor deze klinische gegevens 2. Naast het leveren van een verklaring voor deze klinische data, onze bevindingen in Palmer et al.. 2 suggereren dat TCS richt signaalmoleculen stroomafwaarts van calcium influx. Vanwege het belang van calcium signaling in vele immunologische en andere biologische processen zouden TCS mogelijke nadelige effecten op een grote verscheidenheid van biologische processen noodzakelijk. In feite, Udoji et al.. 39 toonde aan dat TCS onderdrukt menselijke natuurlijke killer cel lytische activiteit, een andere belangrijke aangeboren immuunsysteem. Naast zijn potentieel als een therapeutisch hulpmiddel bij allergische huidziekte (of, omgekeerd, als immunotoxicant) kan TCS ook endocriene verstoorder is 40-49. Zo, een duidelijke procedure over hoe dit chemisch bereiden in oplossing is van belang zijn voor toxicologen. Omdat TCS is een klein hydrofoob molecuul, zijn organische voertuigen vaak gebruikt om het meer in water oplosbaar te maken. In de meeste toxiciteit wanneer TCS is getest, is betrokken preparaat oplossing in water met behulp van een organisch oplosmiddel zoals ethanol, aceton of olie 2,50,51. Echter, vaak tijden deze oplosmiddelen zijn biologisch actieve zelf, daardoor bemoeilijkt de interpretatie van de test chemische gegevens 51. In feite, volgens Rufli et al.. 52 en 53 anderen, wordt aanbevolen dat testoplossingen voor aquatische toxiciteit experimenten worden bereid met fysische werkwijzen via chemische werkwijzen vanwege de mogelijke chemische oplosmiddelen toxiciteit voorwerpen creëert. We hebben eerder aangetoond dat TCS opgelost in 0,24% ethanol / water (vol / vol) en gesoniceerd gedurende 30 min dempt RBL mestcel degranulatie 2. Ethanol bij hogere concentraties dan 0,24% is aangetoond mast cell afbraak dempennulation 54,55-voorbeelden van de potentieel verstorende effecten van organische oplosmiddelen op toxiciteit. Niet alleen is het belangrijk om het effect van oplosmiddelen op het organisme of cellen voor onderzoek beschouwen, maar het is ook belangrijk om het effect van een oplosmiddel toezicht op de teststof zelf. Bijvoorbeeld, Skaare et al.. 51 vonden dat oplossen TCS in polyethyleenglycol (vaak gevonden in tandpasta en mondwater) verzwakt anti-bacterieel en anti-plaque effecten bij gezonde vrouwelijke vrouwen, terwijl oplossen in olie als gevolg van een volledig verlies van functie. Daarom is het vermogen van verschillende oplosmiddelen te moduleren ingedeeld en geneesmiddelen met inbegrip TCS, het effect worden overwogen in deze ontwerpen. Gebruik van oliën of smaakstoffen kunnen interfereren met de effecten van TCS in diverse producten 50,51. In een poging om de noodzaak om organische oplosmiddelen te elimineren, verbeterde we op onze werkwijze voor het oplossen TCS 2 door het elimineren van het gebruik van een organisch solventileren. In het huidige protocol, ontbinden we TCS korrels direct in waterige buffer met warmte (≤ 50 ° C), en controleer de concentratie van deze TCS voorraad door UV-Vis spectrofotometrie. Deze verbeteringen zijn mogelijk omdat TCS is oplosbaar in water tot 40 uM ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) en is aangetoond dat afbraak weerstaan ​​bij verhitting tot 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. We hebben ook het extra voordeel van UV-Vis spectrofotometrie als bedrijf ook bekend dat sterk absorbeert bij 280 nm 58 met een molaire extinctiecoëfficiënt van 4200 L / mol / cm 12. Dit protocol voorziet in een eenvoudige, maar effectieve manier om TCS korrels oplossen in een buffer zonder de hulp van een organisch oplosmiddel, zoals lage kosten en snelle verificatievan de concentratie, en beschrijft een krachtige fluorescerende microplate assay voor de monitoring chemische effecten op mestceldegranulatie.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

Mestcellen spelen een belangrijke rol bij allergische ziekten en immunologische afweer tegen parasieten. Eenmaal geactiveerd (bijvoorbeeld door een allergeen), zij degranuleren, een proces dat resulteert in de exocytose van allergische mediatoren. Modulatie van mestceldegranulatie door geneesmiddelen en toxische stoffen kunnen positieve of negatieve effecten op de menselijke gezondheid hebben. Mestcel functie ontleed in detail het gebruik van rat basofiele leukemie mestcellen (RBL-2H3), een algemeen aanvaard model van menselijke mucosale mestcellen 3-5. Mestcel granule component en allergische mediator β-hexosaminidase, dat lineair wordt vrijgegeven samen met histamine uit mestcellen 6, eenvoudig en betrouwbaar kunnen worden bepaald door reactie met een fluorogeen substraat, waardoor meetbare fluorescentie-intensiteit in een microplaat test die vatbaar is voor high-throughput studies 1. Oorspronkelijk gepubliceerd door Naal et al.. 1, hebben we deze degranulatie assay aangepast voor de screening of geneesmiddelen en toxische stoffen en demonstreren het gebruik ervan hier. Triclosan is een breed-spectrum antibacterieel middel dat aanwezig is in vele consumentenproducten en is gevonden om een therapeutisch hulpmiddel bij humane allergische huidziekte 7-11, hoewel het mechanisme voor dit effect is niet bekend. Hier laten we een test voor het effect van triclosan op mestcel degranulatie. We toonden onlangs aan dat triclosan sterk beïnvloedt mestcel functie 2. In een poging om het gebruik van een organisch oplosmiddel te voorkomen, triclosan direct opgelost in een waterige buffer met warmte en roeren, en de resulterende concentratie wordt bevestigd met UV-Vis-spectrofotometrie (met ε 280 = 4.200 L / M / cm) 12. Dit protocol heeft het potentieel om te worden gebruikt met een verscheidenheid van chemicaliën om hun effecten op mestcel degranulatie bepalen, en meer algemeen, de allergene eigenschappen.

Bij verwarmen tot 50 ° C gedurende 90 min, UV-Vis absorptie spectrum voor TCS produceert een sterke, gladde kromme tussen ~ 260 en 300 nm, met een piek bij 280 nm, zoals getoond in figuur 1. UV-Vis spectrofotometrie is daarom een belangrijk instrument dat kan worden gebruikt om de concentratie te berekenen, omdat de gepubliceerde molaire absorptiecoëfficiënt bij 280 nm 4.200 L / mol / cm 12. Wij hebben gevonden dat TCS niet vallen uit oplossing gedurende het tijdsbestek van de degranulatie gehele experiment, n...

Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mastceldegranulering, de vrijlating van allergische mediatoren, is belangrijk bij allergie, astma, en parasiet defensie. Technieken 1 voor de beoordeling van effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen op degranulatie Hier laten we zien, methodologie onlangs gebruikt om de krachtige remmende effect van antibacterieel middel triclosan 2 vertonen.

Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Onderzoek naar de effecten van probiotica op Pneumococcal Kolonisatie Met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Hechting Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Fluorescentie gebaseerde neuraminidase remmingstest om de gevoeligheid van de influenza virussen zijn voorgesteld om de neuraminidase remmer Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Effecten van blootstelling van Formaldehyde aan een Rat Model van atopische Dermatitis veroorzaakt door neonatale capsaïcine behandeling

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...