Name: a protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits at JoVE.com

Este projeto foi parcialmente financiado por um IOS NSF (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Grant Seed (2011-04375), e Sir Frederick McMaster Bolsa de Investigação para ABD.

Uma representação gráfica do processo descrito abaixo (Figura 1) destaca os dois componentes principais para a selecção de afinidade utilizando uma biblioteca de exibição em fagos: A) uma biblioteca de cDNA de apresentação de fagos provável que codificam proteínas com afinidade para o isco e, B) um isco recombinante purificada proteína. Produção de isca (proteína recombinante) tem sido extensivamente examinada e literatura descrevendo as melhores práticas para garantir, a proteína recom...

<ol>
	<li>Georgieva, Y., Konthur, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+screening+of+M13+phage+display+cDNA+libraries.">Design and screening of M13 phage display cDNA libraries.</a> Molecules. 16, 1667-1681 (2011).</li><li>Beghetto, E., Gargano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda-display:+a+powerful+tool+for+antigen+discovery.">Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery.</a> Molecules. 16, 3089-3105 (2011).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORF+phage+display+to+identify+cellular+proteins+with+different+functions.">ORF phage display to identify cellular proteins with different functions.</a> Methods. 58, 2-9 (2012).</li><li>Willats, W. 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Cell Fact. 4, 2859 (2005).</li><li>Gasser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+conformational+stress+in+microbial+cells+producing+recombinant+proteins:+a+host+comparative+overview.">Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview.</a> Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).</li><li>Daly, R., Hearn, M. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+heterologous+proteins+in+Pichia+pastoris:+a+useful+experimental+tool+in+protein+engineering+and+production.">Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.</a> J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).</li><li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines.">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).</li><li>Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+microarrays+for+the+high-throughput+identification+of+protein-protein+interactions.">Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions.</a> Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).</li><li>Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cold-shock+response+in+cultured+mammalian+cells:+Harnessing+the+response+for+the+improvement+of+recombinant+protein+production.">The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production.</a> Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li></ol>

Ao executar o experimento em três poços replicados, fago adquirida independentemente de a mesma ligação com a proteína de isca pode ser distinguida, mesmo se eles são o mesmo clone (isto é, não houve diferença na sequência de nucleótidos da região de CDS que foi adquirido, mas estes têm sido recuperado a partir de poços independentes). Caso contrário, a única maneira de diferenciar entre o fago que codifica para a mesma ligação com a proteína isco é, se eles são independentemente inverter r...

Por que usar de apresentação de fagos e seleção de afinidade em vez de uma miríade de outras técnicas disponíveis para descobrir e investigar as interações de proteínas com outras moléculas? Phage display pode reivindicar algumas vantagens únicas em relação a outros métodos de detecção de interações proteína-ligante 1-3 incluindo o seguinte: Muito amplo repertório de moléculas de isca A principal razão é na diversidade de moléculas capazes de actuar como isco na selecção por afinidade 4. A exibição em fagos é um meio muito poderoso para isolar fragmentos de proteínas que interagem com outras proteínas, hidratos de carbono, nucleótidos, etc 5 Essencialmente, se um polímero / molécula pode ser ligada a um suporte recuperável, que podem ser rastreados para afinidade com as proteínas apresentadas em fagos. Além disso, a molécula de isca pode ser acedido para determinar se ele retém a actividade biológica quando imobilizada 6, se as condições usadas para reduce / eliminar a sua actividade são eficazes ou 6, para introduzir as modificações pós-tradução para o isco antes da selecção de afinidade. Resistência aos fagos a fatores externos Uma segunda razão para a utilização de apresentação de fagos, é que é possível que alguns iscos pode exigir esforço ambiental (calor, altas concentrações de agente osmótico, co-factores específicos, etc.) Para capturar as proteínas que interagem com, ou as proteínas apresentadas em fagos pode necessitar ser de alguma forma alterados antes da selecção de afinidade. O factor principal a ser estudado é a interacção entre o isco e proteína, não a condição que permite a interacção ocorrer, ou se é letal para o organismo de teste. O fago T7 é particularmente bem adequada para estes estudos porque pode suportar condições experimentais agressivos tanto intacta e viável (por exemplo, o máximo térmico publicado para a viabilidade de T7 é ~ 60 ° C 7). Como um exemplo de alteração fago exibido próproteínas, ao analisar o proteoma semente Arabidopsis thaliana para substratos de proteínas da enzima de reparação, Proteína Isoaspartyl Metil Transferease (PIMT), o vírus utilizado nestes estudos foi &quot;idade&quot;, durante uma semana, antes de cada seleção afinidade rodada, para incentivar a introdução de isoaspartate (isoAsp) resíduos de proteínas suscetíveis 6 que não é possível em organismos que podem reconhecer e reparar / metabolizam essas anormalidades. Metabolicamente inerte Além disso, os fagos são geralmente resistentes aos venenos metabólicos e interferindo pequenas moléculas que, no mínimo, resultar em efeitos pleiotrópicos sobre organismos de teste metabolicamente activas. Após as lavagens de rigor, o veneno é removido antes de uma grande quantidade de bactérias são introduzidos por infecção de modo que o veneno é diluída a uma gama inócuo para a bactéria ou a replicação do fago subsequente. Ao investigar alvos da proteína do reparo PIMTenzima, de S-adenosil-metionina (AdoMet) foi usado para activar a enzima de micro-titulação de placa-bem imobilizada para permitir a captura de proteína alvo, baseando-se S-adenosil-homocisteína (AdoHcy) para inactivar a enzima e proporcionar um controlo negativo útil fixar em do conhecimento que o vírus não seria influenciada negativamente por qualquer AdoMet ou AdoHcy 6. Além disso, os membros de certas famílias Abundante embriogénese tardia (LEA), proteína investigados neste laboratório, são conhecidos para alterar a sua forma, na presença de aditivos tais como sacarose, 8, que podem atingir concentrações tão elevadas como 200 mM em sementes de soja, no ponto de maturidade fisiológica 9. O vírus não está prevista para ser influenciado pela adição de 200 mM de sacarose em cada fase de selecção de afinidade, possivelmente necessário para certas interações proteína LEA-cliente, o que não é o caso de organismos de teste de forma autônoma viáveis ​​10. Este laboratório tem se concentrado em DESCOBERTAg interações proteína-proteína em, sementes desidratadas ou germinando maduros que fundamentam o mecanismo de proteção proteoma armazenadas durante 11 desidratação ou reparação de componentes do proteoma armazenado que são suscetíveis à formação isoAsp uma vez que a semente tem absorvido 6. Assim, a produção e purificação de proteínas recombinantes exigidos como isca em um estado ativo, e garantir que eles permaneçam assim, antes e depois de serem imobilizados, embora freqüentemente difícil, é um dos pilares para o nosso trabalho. No entanto, como cada um dos cenários de produção de proteína recombinante é diferente, as condições para a optimização da produção de proteína recombinante não será abordada aqui. Os utilizadores são convidados a tentar, sempre que possível, para determinar se a proteína imobilizada é funcional (por exemplo, se se trata de uma enzima, fazer um ensaio de enzima nos poços da placa de microtitulação). Isto irá fornecer alguma confiança de que a isca é biologicamente ativo e, portanto, que todas as interações são descobertosum pouco mais propensos a ter relevância biológica.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>Becton Dickinson Co.</td>
 <td>211705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>212750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>214010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP358-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Research Products International</td>
 <td>A20090</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocking Reagent</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td>69064</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP337-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP359-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1145-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Escherichia coli BLT5403</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td>BLT5403</td>
 <td>Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ampicillin, Sodium Salt</td>
 <td>Research Products International</td>
 <td>A40040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ethidium bromide</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP102-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>A-9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penta-HIS primary antibody</td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>34660</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>A-5153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>para-nitrophenylphosphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>N-7653</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T7-UP primer</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td></td>
 <td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T7-DOWN primer</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td></td>
 <td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>28104</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick Gel Extraction kit </td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>28706</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
 <td>Invitrogen Life Technologies</td>
 <td>4336917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td>
 <td>18780</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 Well Cell Culture Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>Costar 3590</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isotemp Incubator Oven</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>516D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipets, 5 &frac34;"</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>13-678-20A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChromaView Transilluminator</td>
 <td>UVP Inc.</td>
 <td>TS-15</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Shield</td>
 <td>Oberon</td>
 <td>071AF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gloves, Nitrile</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>19-170-010C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile 1.5 ml tubes</td>
 <td>USA Scientific Inc</td>
 <td>1615-5500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml borosilicate Pipets</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>13-678-25E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate culture tubes</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-961-27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uniskan I, ELISA plate reader</td>
 <td>Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland</td>
 <td>Type 362</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits

Usando fago recombinante como um andaime para apresentar várias porções de proteínas codificadas por uma biblioteca de cDNA direcionalmente clonado para moléculas imobilizadas isca é um meio eficiente para descobrir interações. A técnica tem sido largamente usado para detectar interacções proteína-proteína, mas a molécula do isco a ser desafiados não precisa ser restrito a proteínas. O protocolo aqui apresentado foi optimizada para permitir que um pequeno número de iscos para ser exibido em repetições para maximizar a identificação de clones independentes que apresentam a mesma proteína. Isto permite uma maior confiança de que as proteínas que interagem identificados são interagentes legítimos da molécula isca. Monitorando a título de fagos depois de cada selecção de afinidade rodada fornece informações sobre a forma como a selecção por afinidade está progredindo, bem como sobre a eficácia dos controlos negativos. Um meio de titulação do fago, e como eo que se preparar com antecedência para permitir que este processo avance de forma tão eficiente comopossível, é apresentada. Atributos de amplicões obtidos após isolamento de placas independentes são destacadas que pode ser utilizado para determinar quão bem a selecção de afinidade progrediu. Problemas técnicas para minimizar falsos positivos ou de contornar persistentemente recuperado fago tiro são explicados. Meios de reduzir a contaminação viral surto são discutidos.

Ser capaz de prejudicar a capacidade de o isco para interagir com proteínas exibidas em fagos (metabolicamente envenenando o isco) proporciona um controlo negativo potente para esta técnica. Também é aconselhável para determinar se o isco,, quando ligados à placa de microtitulação, mantém a sua função. Ambos os cheques aumentará a confiança que interagem, proteínas exibida de fagos recuperados pela isca nonpoisoned são legítimos. Amostragem de três triplicados de cada cavida...

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A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

A exibição em fagos é uma técnica poderosa para captura de proteínas ou fracções de proteínas que interagem com uma molécula de interesse imobilizada. Uma vez tomada uma decisão sobre o tipo de biblioteca de cDNA de fagos para criar e tela, o protocolo descrito aqui permite a seleção de afinidade eficiente levando à identificação de interagentes.

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