Name: visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining
Uploaded: 2013-09-25T09:00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining at JoVE

ويتم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة NSERC إلى BK وRG. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر Kehe شيه وراسل Hosain الخاصة بهم جولجي كوكس الخبرة تلطيخ.

أجريت جميع التجارب وفقا للمجلس الكندي للرعاية الحيوان والتي وافقت عليها جامعة ليثبريدج، لجنة رعاية الحيوان. 1. تربية وتحفيز اللمس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمر الجرذان الحوامل من الموردين الحيوانية المشتركة أو تولد الجراء في المنزل باستخدام إجراءات تربية المختبر القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيت كل الحيوانات في درجة حرارة الغرفة التي تسيطر عليها تربية (21 ° C)، حافظت على ضوء 12:12 ساعة: دورة الظلام، وتوفير فرص الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما ولدت الجراء والجرذان منزل الإناث بشكل فردي مع أبنائهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب الإجهاد إضافية تتعلق التعامل مع مباشرة بعد الولادة، يبدأ التحفيز عن طريق اللمس من الجراء في P3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يتم التحفيز عن طريق اللمس من ثلاث مرات في اليوم الواحد (9:00 صباحا، 1:00 مساء، و 4:00 مساء) من P3-P21 وينبغي أن الجراء مفطوم من أمهاتهم في P21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استخدام تصميم القمامة الصليب، نصف الجراء الابام كل القمامة سيخضع التحفيز عن طريق اللمس مع النصف الآخر بمثابة الضوابط. تعيين عشوائيا أعداد متساوية من الذكور والإناث الجراء لكل مجموعة. التفريق الجراء تمر التحفيز عن طريق اللمس والضوابط، علامة مجموعة واحدة من الجراء مع علامة دائمة على أرجلها الخلفية والذيل. بمناسبة لابد من إعادة تطبيق كل يوم. </li></ol> عن طريق اللمس تحفيز <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السدود من القفص وطنهم ووضعها في قفص مؤقت مع الغذاء والماء. الحفاظ على السد والقفص مؤقتة في غرفة تربية / الإسكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن الجراء الفئران كمجموعة قبل الدورة التحفيز عن طريق اللمس صباح اليوم (9:00 AM). لكل دورة، الفئران النقل الجراء أقفاص وطنهم إلى غرفة منفصلة لاختبار التحفيز عن طريق اللمس. وضع قفص المنزل على وسادة التدفئة التي تم تعيينها إلى 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحة شديدة لتقسيم قفص المنزل إلى نصفين. وضع الفئران الوليدة في مجموعة التحفيز عن طريق اللمس واحد النصف والسيطرة الجراء في النصف الآخر.تعيين جهاز ضبط الوقت إلى 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام لينة مثل منفضة الريش، وفرشاة جميع الجراء في المجموعة التحفيز عن طريق اللمس في نفس الوقت لمدة 15 دقيقة على التوالي. الجراء الفئران الشابة (~ P3-P12) يتجمع البحري Ususally معا وتظهر لدخول دورة النوم العميق مما يجعل من السهل جدا لتحفيز جميع الجراء في آن واحد. كما سن الجراء، فإنها تصبح أكثر نشاطا، مع بعض الجراء المشي والتحقيق خلال الدورة. المجرب يجب أن تتحرك باستمرار الجراء يتجول في المجموعة لضمان كل الجرو يتلقى التحفيز على قدم المساواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الدورة 15 دقيقة كاملة، نقل الجراء مرة أخرى إلى غرفة تربية وعودة الأم إلى القفص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه العملية ثلاث مرات يوميا لمدة 19 يوما من التحفيز عن طريق اللمس. بعد نهائي دورة التحفيز عن طريق اللمس في P21، ينبغي مفطوم الجراء من أمهاتهم. ثم ينبغي أن يضم الجراء في أقفاص مع 5 أو 6 حيوانات أخرى مفطوم من نفس الجنس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الفئران تشهد أي إجراء اختبارات إضافية، فإنها ينبغي أن يترك للامم المتحدةمضطربا، على ضوء عادي: دورة الظلام مع الحصول على الغذاء والماء libitm الإعلان (جانبا من تنظيف القفص العادية والمناولة) حتى تصل إلى ما يقرب من 100 يوما من العمر. إذا تمر التلاعب تجريبية أخرى، ينبغي أن يعامل الحيوانات أو اختبارها وفقا لتلك البروتوكولات المختبر. </li></ol> 2. التضحية وجولجي كوكس تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حوالي P100، إدارة جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال عن طريق الحقن IP إلى الجرذان ويروي intracardially مع ما يقرب من 100 مل من المياه المالحة 0.9٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج العقول عندما نضح كاملة. إزالة أدمغة من الجمجمة، وقطع العصب البصري تحت مع جهد للحفاظ على المخيخ سليمة؛ قد يختار الباحثون للحفاظ على أو إزالة بصيلات الشم. وضع أدمغة المستخرج في زجاجة Nalgene مبهمة مع 20 مل من جولجي كوكس حل 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء العقول في حل جولجي كوكس لمدة 14 يوما. بعد 14 يوما، استبدال جولجي-Cالحل ثور بمحلول السكروز 30٪. إبقاء العقول في حل السكروز لمدة 2-5 أيام قبل باجتزاء. </li></ol> ملاحظة: إذا كان لا يمكن مقطوع العقول في غضون 14 يوما من نقل إلى حل السكروز، يحتاج الباحث إلى استبدال السكروز مع الأسهم الجديدة من 30٪ سكروز. الباحث قد يحل محل السكروز كل أسبوعين لمدة 4 أشهر مع عدم وجود آثار سلبية على تلطيخ. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل قسم الدماغ، ينبغي نشف الدماغ الجافة وثابتة إلى مرحلة باجتزاء مع الغراء cyanocacrylic. لمنع تمزق أو باجتزاء متفاوتة، يجب أن يكون الباحث حذرا وتأكد من أن الدماغ بأكمله تثبت بإحكام على خشبة المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب ملء الخزان vibratome مع 6٪ محلول السكروز إلى المستوى الذي يغطي شفرة باجتزاء. تعيين المعلمات vibratome إلى سرعة والسعة إلى 5، (نقطة الوسط على كلا المقاييس). شريحة الدماغ إلى 200 ميكرون أقسام ووضع الأقسام في الصغر مهيلم 2٪نطاق الشريحة. تأكد للحفاظ على أقسام الرطب أثناء باجتزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم جمع كافة المقاطع من الفائدة، والضغط على المقاطع على الشرائح عن طريق الضغط على الشرائح مع ورقة ماص مبلل. تخزين الشرائح في رفوف الشريحة في غرفة الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة. يجب أن تبقى في غرفة الرطوبة لمدة 12 ساعة على الأقل، ولكن ليس لفترة أطول من 4 أيام. الشرائح تحتاج إلى أن تكون رطبة، وينبغي عدم السماح لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفوج تلطيخ قبل بدء عملية تلطيخ. تسمية اثني عشر أطباق الزجاج تلطيخ (10.7 × 8.5 × 6.8 سم) والعملية على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماء المقطر - 1 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدروكسيد الأمونيوم - 30 دقيقة (في الظلام) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماء المقطر - 1 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كوداك إصلاح للسينما - 30 دقيقة (في الظلام) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماء المقطر - 1 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50٪ كحول - 1 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70٪ كحول - 1 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95٪ كحول - 1 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100٪ Alcohرأ - 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100٪ الكحول - 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل (1/3 الكلوروفورم، 1/3 HemoDe، 1/3 100٪ كحول) - 15 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HemoDe - 15 دقيقة </li></ol></li></ol> * الزيلين يمكن أن تستخدم في استبدال من HemoDe. من أجل ضمان جودة تلطيخ متسقة، وينبغي أن تستخدم حلول جديدة لكل رف الشريحة معالجتها. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 15 دقيقة مشاركة في الطلوع HemoDe، ساترة الشرائح مع Permount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح للهواء الجاف قبل دراسة بالمجهر. </li></ol>

<ol>
	<li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+matters:+Brain,+behaviour,+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats.">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li><li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex.">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li><li>Wiesel, T., Hubel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+visual+deprivation+on+morphology+and+physiology+of+cells+in+the+cat's+lateral+geniculate+body.">Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body.</a> Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).</li><li>Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+effects+of+nicotine+on+the+developing+brain.">The dynamic effects of nicotine on the developing brain.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 122, 125-139 (2009).</li><li>Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+alters+behaviour+and+neuroanatomical+organization+of+normal+rats.">Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats.</a> Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).</li><li>Schanberg, S., Field, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+deprivation+stress+and+supplemental+stimulation+in+the+rat+pup+and+preterm+neonate.">Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate.</a> Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).</li><li>Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care+during+infancy+regulates+the+development+of+neural+systems+mediating+the+expression+of+fearfulness+in+the+rat.">Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).</li><li>Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+tactile+stimulation+reverses+the+effect+of+neonatal+isolation+on+open-field+and+anxiety-like+behavior,+and+pain+sensitivity+in+male+and+female+adult+Sprague-Dawley+rats.">Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats.</a> Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).</li><li>Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+promotes+motor+recovery+following+cortical+injury+in+adult+rats.">Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats.</a> Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).</li><li>Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+and+maternal+separation+prevent+hippocampal+damage+in+rats+submitted+to+neonatal+hypoxia-ischemia.">Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia.</a> Brain Research. 1002, 94-99 (2004).</li><li>Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+after+frontal+or+parietal+cortical+injury+in+infant+rats+facilitates+functional+recovery+and+produces+synaptic+changes+in+adjacent+cortex.">Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex.</a> Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).</li><li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner.">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+dell+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello.</a> Gaz Med Lomb. 33, 244-246 .</li><li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy:+Application+of+a+new,+high+clarity+Golgi-Nissl+stain.">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li><li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care,+gene+expression,+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations.">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li><li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لدينا مصالح المالية المتنافسة.

بسبب اللدونة العلني من الدماغ النامية، فمن المهم أن الإجراءات التجريبية التي تنطوي على خبرات مبكرة تتم مراجعة شاملة وتبذل محاولات للسيطرة على جميع المتغيرات المتدخلة. لهذا السبب، يعمل تصميم القمامة عبر أثناء إجراء التحفيز عن طريق اللمس لضمان أن الجراء يتلقون تجارب مماثلة في كافة المجالات الأخرى للتنمية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من المهم أيضا أن يتم اختيار الجراء متعددة من الفضلات متعددة للتحليل لتجنب احتمال أن الآثار الناتجة عن وجود تحيز في الجرو واحد أو القمامة. ويعتقد التحفيز عن طريق اللمس لتقليد سلوك الأمهات التي تحدث بشكل طبيعي، ولعق الاستمالة، والتي يعتقد أن تكون مفيدة لتطوير النسل. على الرغم من أن أكدت الأبحاث قبل الأسبوع الأول من الحياة (P0-P7) أن تكون فترة حرجة للعق والاستمالة 16، وضخامة التغيير المحددة التالية 18 يوما من تاالتحفيز ctile قد يعني أنه على الرغم من وجود الاوقات الحساسة، والتعرض يعد هو الافضل. من المهم أيضا أن نلاحظ أن الجراء تلقي التحفيز عن طريق اللمس في هذا النموذج التجريبي أيضا تجربة لعق والاستمالة من قبل أمهاتهم، وبالتالي تحفيز اللمس بالإضافة إلى التحفيز الطبيعي تدار من قبل الأم. أخيرا، يجب على المرء أيضا أن يكون مدركا للتغيرات التي تعتمد على المنطقة. على الرغم من التحفيز عن طريق اللمس أثناء تطوير زيادة التعقيد شجيري في قشرة الفص الجبهي، وهذا لا يضمن أن التغييرات الهيكلية من هذا النوع سوف يكون واضحا في جميع مناطق الدماغ. فمن الممكن أن مورفولوجيا الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى مثل القشرة الجدارية، سترد بطريقة مختلفة لافت للنظر لنفس التجربة. ومع ذلك، لأن الإجراء التحفيز عن طريق اللمس تدار بسهولة ولا تشكل أي خطر على ذرية أو السدود، فمن لديه القدرة ليكون بمثابة أداة قيمة بالنسبة للعديد من البحوث والدراسات التي تهدف إلى تحسين التنميةآل النتائج. فيما يتعلق جولجي كوكس تلطيخ من أنسجة المخ، والخطوات الحاسمة لتصور الخلايا العصبية الناجحة هي كما يلي: 1) يجب أن يكون هناك التروية الكافية للدماغ مع محلول ملحي. نضح غير لائق أو غير كافية من النتائج أنسجة المخ في التحف الأوعية الدموية التي تجعل من الصعب فعلا تصور الخلايا العصبية من خلال متاهة من الأوعية الدموية، في حين يعقد أيضا القدرة على تصوير الخلايا العصبية الملون. 2) يجب أن يتم تخزينها في أدمغة Perfused جولجي كوكس الحل والحل السكروز في الظلام. تخزين أنسجة المخ في الظلام يقلل من تلوين الخلفية من الأنسجة، وزيادة مرة أخرى فرصة لتصور الخلايا العصبية بنجاح الجودة. 3) يتم تخزينها في أنسجة الدماغ حل السكروز بعد 14 يوم تخزين في حل جولجي كوكس. عندما يتم غمر النسيج في محلول السكروز 30٪ لمدة 2-5 أيام، والعقول هي أكثر مرونة مما يمنع تحطيم وتمزيق أقسام عندماالقطع. من المهم لمنع أنسجة المخ من المتبقية في حل السكروز لزيادة الفترات الزمنية (ما لم يتم استبدال حل السكروز باستمرار مع حل جديد) بسبب التخزين لفترات طويلة في السكروز يقلل من جودة تلطيخ. 4) وأخيرا، بمجرد ملطخة الشرائح وتراجع الغطاء، ينبغي أن تعطى الوقت الكافي لتجف قبل التصور مع المجهر. إذا لم يتم السماح الشرائح في الهواء الجاف على نحو كاف، والأنسجة قد تلقي بظلالها، والحد من التصور ناجح من الخلايا العصبية القشرية. ويعتقد أن التغييرات استقرارا في الأداء النفسي والاستجابات السلوكية التي تحدث استجابة لخبرات لأن تيسره إعادة تنظيم مورفولوجيا الخلايا العصبية واتصال متشابك 17. كما توفر هذه التغييرات الهيكلية مورد قابلة للقياس تعتمد على الخبرة اللدونة، واستخدام إجراء تلطيخ موثوقة هو المهم. يوفر هذا الإجراء على أساس vibratome تلطيخ جولجي كوكس وصمة عار موثوقةفروع غرامة والعمود الفقري شجيري التي قد لا يكون واضحا مع البروتوكولات الأخرى مثل سيلويدين التضمين جي. تميز الإجراء جولجي كوكس ينبع من قدرتها على صمة عار سوى جزء صغير من عناصر الخلايا العصبية (1-10٪)، والذي يسمح بتعقب الخلايا العصبية واحد لمسافات طويلة. على الرغم من حقيقة أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخلايا العصبية والمشرب مع وصمة عار، والخلايا التي يتم تقديمها مرئية، والحفاظ على جميع الميزات بما في ذلك خلايا الجسم، التشعبات، العمود الفقري شجيري ومحاور عصبية. علاوة على ذلك، عند تنفيذ الإجراء تلطيخ خارج بشكل صحيح، فإن الخلايا الملون تبرز بوضوح وصراحة على خلفية شفافة لأن الهياكل القشرية الأخرى لا تزال غير ملوثين وشفافة. نظرا لإدراك أن التغيرات المستمرة في سير الخارج يجب أن تكون ذات صلة اللدونة من الجهاز العصبي، أي قدرة الخلايا العصبية لتعديل هيكلها والاتصال، ويوفر الإجراء تلطيخ جولجي كوكس الباحثين معتقنية يمكن الاعتماد عليها لتصور وقياس هذا اللدونة.

على الرغم من أن هناك العديد من التقنيات وذكرت والاستفادة منها للفحص في وقت مبكر من الخبرات السلبية على نضوج الدماغ، مثل الإجهاد في الفترة المحيطة بالولادة 1،2، 3 الحرمان الحسي، وسمية الدواء 4، وهناك عدد قليل جدا من المنهجيات المستخدمة لدراسة آثار التجارب الإيجابية في هذه الفترة الزمنية. وبصرف النظر عن تخصيب البيئية، وتحفيز اللمس هي واحدة من عدد قليل من الدماغ تعزيز العلاج مع تأثيرات أظهرت 5. التحفيز عن طريق اللمس هو طريقة التحفيز الحسي على الجلد الذي يحاكي سلوك الفئران الأمهات، ولعق الاستمالة. القبول العام بوصفها التلاعب إيجابية ينشأ من الدراسات تشير إلى أن التحفيز عن طريق اللمس المحسنة نضوج الأطفال الخدج حديثي الولادة والجرذان 6. بالإضافة إلى ذلك، وقد أثبتت الأبحاث في المختبر ل Meaney 7 أن مستويات أعلى من لعق الأمهات والاستمالة ترتبط نتائج إيجابية في النسل. بسبب رالتأثيرات الإيجابية ذات المناظر، والتحفيز عن طريق اللمس تطورت بسرعة إلى استراتيجية علاجية تهدف إلى الحد من القلق 8، وتحسين النتائج المرتبطة إصابات الدماغ 9-11، وتخفيف توعية المخدرات 12. على هذا النحو، والتحفيز عن طريق اللمس هو أسلوب قيمة لتعزيز الخبرات الإيجابية في وقت مبكر، مع القدرة ثبت لإعادة تنظيم بشكل كبير مورفولوجيا الخلايا العصبية واتصال متشابك من الدماغ النامية. من أجل دراسة وقياس التغيرات في التشكل العصبية، فمن الضروري لتصور الخلايا العصبية سليمة. الإجراء تلطيخ جولجي كوكس هو تعديل لتقنية كاميلو غولجي نشرت في أواخر 1800s يوفر تلطيخ منفصلة من عدد صغير من الخلايا العصبية كاملة 13. على الرغم من أن الإجراء يبدو أن وصمة عار الخلايا العصبية عشوائيا واستشهد استنساخ باسم خللا رئيسيا، والتصور تصاريح معدل التبويض صغيرة من العنصر العصبية بأكملها، بما في ذلك مالهيئات ليرة لبنانية، التشعبات، العمود الفقري شجيري، ومحاور عصبية. وبالمثل، فإن الوقت المطلوب لتلقيح الدماغ تعطى مع حل جولجي كما تم الاستشهاد باعتباره سقوط. ومع ذلك، نظرا لأنه بمجرد تلطيخ هو يمكن الحفاظ الأنسجة كاملة إلى أجل غير مسمى، والوقت بين التروية للدماغ والتصور من الخلايا العصبية مع المجهر يمكن أن تكتمل في أقل من 21 يوما، والفترة الزمنية ليست غير معقولة. بالإضافة إلى ذلك، مع تعديلات طفيفة على بروتوكول، جولجي كوكس تلطيخ يمكن استخدامها بشكل فعال في تلقيح أدمغة القوارض من جميع الفئات العمرية. كما تم ربط التغيرات في المستوى الهيكلي للتعديلات المستمرة لسير السلوكية والنفسية، وتوفر هذه التقنية تلطيخ جولجي كوكس الباحثين مع أداة قيمة لقياس المرونة العصبية.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dichromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercuric Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1561</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak Rapid Fix</td>
			<td>Vistek</td>
			<td>Kodak 146 4016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH-95 &amp; Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>No Cat Numbers</td>
			<td>All other Et-OH are dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td>
			<td>Safeway</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Can be found at most grocery stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemoDe</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>23410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Sp15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-365</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>062011-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining

لتوليد التغييرات على المدى الطويل في السلوك والخبرات يجب أن تنتج تغييرات مستقرة في مورفولوجيا الخلايا العصبية واتصال متشابك. التحفيز عن طريق اللمس هو تجربة إيجابية في وقت مبكر أن يقلد الأم لعق والاستمالة في الفئران. تعريض الفئران الوليدة لهذه التجربة الإيجابية يمكن أن تكتمل بسهولة وفعالية من حيث التكلفة عن طريق استخدام مواد للوصول للغاية مثل خرقة المنزلية. باستخدام تصميم عبر القمامة، والجراء إما القوية أو اليسار دون عائق، لمدة 15 دقيقة، ثلاث مرات في اليوم الواحد طوال فترة ما حول الولادة. لقياس التغيرات المرونة العصبية المرتبطة بهذا تجربة إيجابية في وقت مبكر، ويستخدم جولجي كوكس تلطيخ من أنسجة المخ. نظرا لحقيقة أن جولجي كوكس التشريب البقع عدد محدد من الخلايا العصبية بدلا من كافة الخلايا، وتلطيخ من الدماغ القوارض مع حل جولجي كوكس يسمح التصور من عناصر الخلايا العصبية بأكملها، بما في ذلك خلايا الجسم، التشعبات، المحاور، و العمود الفقري شجيري. الإجراء ط تلطيخقامت ليالي على مدى عدة أيام، ويتطلب أن الباحث إيلاء اهتمام وثيق للتفاصيل. ومع ذلك، بمجرد الانتهاء من التلوين، وقد مشربة الدماغ بأكمله، ويمكن الحفاظ عليها لأجل غير مسمى لتحليل الجارية. وبالتالي، جولجي كوكس تلطيخ هو مصدرا قيما لدراسة تعتمد على الخبرة اللدونة.

عندما اتبعت هذا الإجراء تلطيخ بشكل مناسب، يتم إنشاء تلطيخ متسقة وموحدة من التشعبات والعمود الفقري. انظر الشكل 1 لتمثيل جولجي كوكس تلطيخ الخلايا العصبية. ينتج هذا الإجراء تلطيخ التي هي مماثلة لوضعت حديثا في أساليب المختبر، ويجوز له أن يسمح التصور من الحقول شجيري التي هي غير المنقطعة تضمين الأنسجة التالي. تم العثور على تقنية vibratome القائمة على جولجي كوكس تلطيخ لإنتاج تلطيخ أكثر انتشارا من فروع محطة والخلايا العصبية الهرمية، من تلطيخ مع إما جزءا لا يتجزأ من سيلويدين ومقطوع ناظم البرد الأنسجة، 15. علاوة على ذلك، لأن هذا الأسلوب من تلطيخ يلقح الدماغ بأكمله، وجميع أقسام يمكن تحليلها إما فورا أو في المستقبل. كموقع التغيير الصرفي هو ليست واضحة دائما عند إنشاء فرضية الأصلي، وهذه العملية تسمح لاستكشاف مناطق الدماغ إضافيد يمنع التخلص من الأنسجة التي قد تكون مفيدة في المستقبل. هذا الأسلوب تلطيخ يمكن استخدامها لتلطيخ موثوقة من أي أدمغة الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين (عمر P0 القديمة). ومع ذلك، عندما تلطيخ أدمغة الشباب (&lt;1 غرام)، ينبغي أن يظل الدماغ فقط في حل جولجي كوكس لمدة 6 أيام بدلا من يوم 14 الموصى به لأدمغة البالغين؛ تقام جميع الإجراءات الأخرى ثابتة. الصعوبة الرئيسية التي يمكن مواجهتها أثناء هذه العملية تلطيخ جولجي كوكس هو عدم القدرة على انتاج عالية الجودة تلطيخ من مناطق الدماغ المركزية، بما في ذلك المهاد. كما هو مشربة الدماغ بأكمله في نفس الوقت، المناطق الوسطى قد لا تتلقى تركيزات مثالية من وصمة عار. على الرغم من هذه النتيجة، وتقنية جولجي كوكس تنتج تلطيخ استثنائية من المناطق تحت القشرية مثل الحصين والمخطط. وجود قيود النهائي من الإجراء ينشأ من إزالة كاملة من الدم من المخ أثناء عملية الارواء. قد تنتج الدم التحف في أنسجة المخالذي يجعل من الصعب تصوير وتتبع الخلايا العصبية. توفر تقنيات تلطيخ جولجي كوكس مقياسا يمكن الاعتماد عليها من التشكل شجيري والتشريح العصبي يمكن أن يكون مفيدا لمجموعة واسعة من الدراسات تهدف إلى دراسة التغيرات على مستوى الخلايا العصبية. عند دراسة بنية الخلايا العصبية في القشرة قبل الجبهية التالية التحفيز عن طريق اللمس في فترة مبكرة بعد الولادة، وكشف جولجي كوكس تلطيخ زيادات هائلة في التعقيد شجيري. يمكن البرهنة التغيرات التشريحية المتعلقة التحفيز عن طريق اللمس في وقت مبكر بصريا من خلال مقارنة كثافة العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية من الفئران السيطرة على الخلايا العصبية الهرمية من الفئران التي خضعت التحفيز عن طريق اللمس (انظر الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، المعلمات مثل تشجر شجيري، وطول شجيري، وكثافة العمود الفقري يمكن أن يحسب إحصائيا وتحليلها لتوليد البيانات المستمرة التي يمكن مقارنتها عبر الحيوانات. لتوليد نتائج موثوقة، ينبغي إجراء تحليل للخروج على صباحاوينبغي اختيار inimum من ثلاثة حيوانات في مجموعة العلاج وحوالي خمسة الخلايا العصبية في نصف الكرة عشوائيا في كل منطقة في الدماغ قيد التحليل. يوضح الشكل 2 تعقيد شجيري (العمود الفقري / ميكرومتر ميكرومتر العاشر من التغصنات) من الحيوانات التي تلقت التحفيز عن طريق اللمس والحيوانات التي لم . في كل من المجالات قمية والقاعدي من الخلايا العصبية تحليلها من mPFC (CG3)، أدى التحفيز عن طريق اللمس في انتشار المعلمات العصبية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> الشكل 1. صورة الممثل ألف من جولجي كوكس ملطخة الخلايا العصبية الهرمية من الطبقة الثالثة من منطقة CG3 في الفئران التي تلقت التحفيز عن طريق اللمس خلال التنمية. B. الممثل تضخيم (1،000 X) صورة من العمود الفقري شجيري على التشعبات الطرفية في مجال القاعدي للCG3 ؛ الصورة أخف على اليسار هو للفأر في السيطرة على المجموعة وصورة أكثر قتامة على ريGHT هو من الفئران الذين تلقوا التحفيز عن طريق اللمس. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> الشكل 2. التمثيل توضيحية من متوسط ​​التعقيد شجيري قمية والقاعدي (العمود الفقري / ميكرومتر ميكرومتر س) لالخلايا العصبية في منطقة CG3 من الفئران الكبار إما أن تلقى التحفيز عن طريق اللمس أثناء التطوير أو لم (* ع &lt;0.01).

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining at JoVE

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

تصور الآثار المترتبة على تجربة إيجابية في وقت مبكر، اللمس تحفيز، على مورفولوجيا شجيري ومتشابك الربط مع جولجي كوكس تلطيخ

وتصف هذه الورقة إجراءات التحفيز عن طريق اللمس من الفئران الوليدة واللاحقة تلطيخ جولجي كوكس مورفولوجيا الخلايا العصبية. التحفيز عن طريق اللمس هي تجربة الإيجابية التي تدار في فترة ما حول الولادة بواسطة التمسيد الجراء مع منفضة المنزلية. جولجي كوكس تلطيخ هو إجراء موثوق يسمح التصور من الخلايا العصبية بأكملها.

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

التبعية للدولة التأثيرات على TMS : نظرة على سلوك الدافع وبصة

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

تقييم التعقيد الجذعي الحصين في الفئران المسنين باستخدام طريقة جولجي-كوكس

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

آثار Transcranial التحفيز التيار المتردد في القشرة الحركية الأولية بنهج موحد على الإنترنت مع التحفيز المغناطيسي Transcranial

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

تصور انهيار مخروط النمو محواري وأوائل آثار بيتا اميلويد في الماوس استزراع الخلايا العصبية

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...