Name: visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining
Uploaded: 2013-09-25T09:00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining at JoVE

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NSERC לBK וRG. המחברים גם רוצים להודות לKehe שיה וראסל חוסיין למומחיות מכתים Golgi-קוקס.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להחלטת המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי האוניברסיטה של ​​Lethbridge, ועדת טיפול בבעלי חיים. 1. רבייה ומישוש גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין חולדות הרות מהספקים בעלי חיים משותפים או להתרבות גורים בתוך הבית באמצעות נהלי רבייה מעבדה סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית כל בעלי החיים בחדר בטמפרטורה מבוקרת רבייה (21 מעלות צלזיוס), שמרה על אור 12:12 שעה: מחזור כהה ולספק גישה למזון ומים כהרצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר גורים נולדים חולדות נקבות בית, בנפרד עם צאצאיהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע לחץ נוסף הקשורים לטיפול מייד לאחר לידה, להתחיל גירוי חוש המישוש של גורים בP3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירוי חוש המישוש צריך להתבצע שלוש פעמים ביום (9:00 בבוקר, 1:00 PM, ו16:00) מP3-p21 ויש נגמלו גורים מאמותיהם ב p21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש בעיצוב המלטת צלב, מחצית מהגורים frאום כל המלטה תעבור גירוי חוש המישוש עם החצי השני שמש כקבוצת ביקורת. באופן אקראי להקצות מספרים שווים של גורי זכר ונקבה לכל קבוצה. כדי לבדל את הגורים עוברים גירוי ובקרות מישוש, לסמן קבוצה אחת של גורים עם סמן קבע על רגליהם האחוריות וזנב. סימון צריך להיות מיושם מחדש בכל יום אחר. </li></ol> מישוש גירוי <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסכרים מהכלוב בבית שלהם ולמקם אותם בכלוב זמני עם מזון ומים. שמור את הסכר וכלוב זמני בחדר רבייה / דיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל גורי חולדה כקבוצה לפני ישיבת הבוקר גירוי חוש המישוש (9:00). עבור כל פגישה, עכברוש תחבורת גורי כלובים בביתם לחדר בדיקות נפרד לגירוי חוש המישוש. מקם את הכלוב בבית על כרית חימום שמוגדרת 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלוח נוקשה לחלק את הכלוב בבית לשני חצאים. הנח גורי חולדה בגורי חצי ושליטה מישוש גירוי קבוצה אחת במחצית השנייה.להגדיר טיימר ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטלית כמו נוצה רכה, מצחצח את כל הגורים בקבוצת גירוי חוש המישוש באותו הזמן ל15 דקות רצופות. גורי החולדה הצעירים (~ P3-P12) ususally להצטופף ביחד ונראים נכנסים למעגל שינה עמוק ולכן קלים מאוד כדי לעורר את כל הגורים בבת אחת. כמו גיל הגורים, הם הופכים להיות יותר פעילים, עם כמה גורים הולכים וחוקרים במהלך הפגישה. הנסיין צריך לעבור ברציפות גורים נודדים לקבוצה כדי להבטיח כל גור מקבל גירוי שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פגישת 15 דקות הושלמה, להעביר את הגורים בחזרה לחדר הגידול ולהחזיר את האמא לכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה שלוש פעמים ביום ל19 ימים של גירוי חוש המישוש. לאחר פגישת גירוי חוש המישוש הסופית ב p21, צריכים להיגמל הגורים מאמותיהם. גורים אמורים להיות שוכנו בכלובים עם 5 או 6 חיות נגמלו אחרות של אותו המין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חולדות עוברות שום בדיקות נוספות, הם צריכים להישאר בלתימופרע, באור הרגיל: מחזור כהה עם גישה למזון ומי libitm מודעה (מלבד ניקוי כלוב וטיפול שוטפים) עד שהם מגיעים כ 100 ימים של גיל. אם עוברים מניפולציות ניסיוניות אחרות, יש להתייחס אל בעלי חיים או נבדקו בהתאם לפרוטוקולי מעבדה אלה. </li></ol> 2. להקריב וGolgi-קוקס מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על כ P100, לנהל ממנת יתר של נתרן pentobarbital באמצעות הזרקת ה-IP לחולדות וינקב intracardially עם כ 100 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח כאשר זלוף הוא מוחלט. הסר את המוח מהגולגולת, חיתוך עצב הראייה מתחת עם מאמץ לשמור על המוח הקטן ללא פגע; חוקרים יכולים לבחור לשמור או להסיר את נורות חוש הריח. הנח מוחות שחולצו בבקבוק Nalgene אטום עם 20 מיליליטר של תמיסת Golgi-קוקס 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המוח בפתרון Golgi-קוקס ל14 ימים. לאחר 14 ימים, החלף את Golgi-Cפתרון שור עם תמיסת סוכרוז 30%. שמור את המוח בתמיסת סוכרוז ל2-5 ימים לפני חתך. </li></ol> הערה: אם אינו יכולים להיות מחולקים מוחות תוך 14 יום מהעברה לתמיסת סוכרוז, החוקר צריך להחליף את סוכרוז עם מלאי חדש של סוכרוז 30%. החוקר עשוי להחליף את סוכרוז כל שבועיים במשך 4 חודשים ללא השפעות שליליות על מכתים. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת סעיף המוח, המוח צריך להטשטש יבש וקבוע לבמה חתך עם דבק cyanocacrylic. כדי למנוע קריעה או חתך אחיד, החוקר חייב להיות זהיר ולוודא שכל המוח הוא מאובטח היטב לבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר vibratome חייב להיות מלא עם 6% תמיסת סוכרוז לרמה שמכסה את להב חתך. הגדר את הפרמטרים vibratome למהירות ומשרעת עד 5, (נקודת האמצע על שני הסולמות). פורסים את המוח ל200 מיקרומטר חלקים ולמקם את הסעיפים על 2% מייקר gelatinizedשקופיות היקף. הקפד לשמור את החלקים רטובים במהלך חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל החלקים של עניין כבר נאספו, לחץ על החלקים על גבי השקופיות על ידי הפעלה לחץ על השקופיות עם נייר bibulous לח. אחסן את השקופיות במעמד שקופיות בתא הלחות עד שהם מוכנים להיות מוכתמים. הם צריכים להישאר בתא הלחות במשך שעה לפחות 12, אך לא יותר מ -4 ימים. השקופיות צריכה להיות לח ולא צריך להיות מותרות להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הגדוד מכתים לפני תחילת תהליך הצביעה. תווית עשר מנות צביעת זכוכית (10.7 x 8.5 x 6.8 סנטימטר) ואת תהליך באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמוניום הידרוקסיד - 30 דקות (בחושך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קודאק תקן לקולנוע - 30 דקות (בחושך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 50% - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 70% - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 95% - 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% Alcohol - 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלכוהול 100% - 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון (כלורופורם 1/3, 1/3 HemoDe, 1/3 100% אלכוהול) - 15 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HemoDe - 15 דקות </li></ol></li></ol> * קסילן ניתן להשתמש בהחלפה של HemoDe. על מנת להבטיח איכות צביעה עקבית, יש להשתמש בפתרונות טריים עבור כל מדף שקופיות מעובד. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות emersion 15 דקות האחרונות בHemoDe, coverslip השקופיות עם Permount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר השקופיות לייבוש באוויר לפני שבודק במיקרוסקופ. </li></ol>

<ol>
	<li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+matters:+Brain,+behaviour,+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats.">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li><li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex.">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li><li>Wiesel, T., Hubel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+visual+deprivation+on+morphology+and+physiology+of+cells+in+the+cat's+lateral+geniculate+body.">Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body.</a> Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).</li><li>Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+effects+of+nicotine+on+the+developing+brain.">The dynamic effects of nicotine on the developing brain.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 122, 125-139 (2009).</li><li>Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+alters+behaviour+and+neuroanatomical+organization+of+normal+rats.">Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats.</a> Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).</li><li>Schanberg, S., Field, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+deprivation+stress+and+supplemental+stimulation+in+the+rat+pup+and+preterm+neonate.">Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate.</a> Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).</li><li>Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care+during+infancy+regulates+the+development+of+neural+systems+mediating+the+expression+of+fearfulness+in+the+rat.">Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).</li><li>Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+tactile+stimulation+reverses+the+effect+of+neonatal+isolation+on+open-field+and+anxiety-like+behavior,+and+pain+sensitivity+in+male+and+female+adult+Sprague-Dawley+rats.">Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats.</a> Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).</li><li>Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+promotes+motor+recovery+following+cortical+injury+in+adult+rats.">Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats.</a> Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).</li><li>Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+and+maternal+separation+prevent+hippocampal+damage+in+rats+submitted+to+neonatal+hypoxia-ischemia.">Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia.</a> Brain Research. 1002, 94-99 (2004).</li><li>Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+after+frontal+or+parietal+cortical+injury+in+infant+rats+facilitates+functional+recovery+and+produces+synaptic+changes+in+adjacent+cortex.">Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex.</a> Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).</li><li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner.">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+dell+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello.</a> Gaz Med Lomb. 33, 244-246 .</li><li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy:+Application+of+a+new,+high+clarity+Golgi-Nissl+stain.">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li><li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care,+gene+expression,+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations.">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li><li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים.

בשל הפלסטיות הגלויה של המוח המתפתח, חשוב שהפרוצדורות הכרוכות בחוויות מוקדמות נבדקות ביסודיות ונעשים ניסיונות לשלוט בכל המשתנים מתערבים. מסיבה זו, עיצוב המלטת צלב מועסק במהלך הליך גירוי חוש המישוש כדי להבטיח שגורים מקבלים חוויות דומות בכל התחומים האחרים של התפתחות. בנוסף, חשוב גם שגורים מרובים מהמלטות מרובות נבחרו לניתוח, כדי למנוע את האפשרות שתופעות נובעות מהטיה בגור או המלטה אחת. הוא האמין גירוי חוש המישוש כדי לחקות את ההתנהגות האימהית הטבעי, מלקק וטיפוח, אשר נחשב כמועיל להתפתחות צאצאים. למרות שהמחקר קודם הדגיש בשבוע הראשון לחייהם (P0-P7) להיות תקופה קריטית לליקוק וטיפוח 16, הגודל העצום של שינוי שזוהה הבא 18 ימים של taגירוי ctile עשוי לרמוז כי למרות שפעמים רגישות קיימות, חשיפה ארוכה יותר היא מעולה. כמו כן, חשוב לציין כי גורים מקבלים גירוי חוש המישוש בפרדיגמה ניסויית זו גם לחוות ללקק וטיפוח על ידי האמהות שלהם, ולכן גירוי חוש המישוש הוא בנוסף לגירוי נורמלי מנוהל על ידי האמא. לבסוף, צריך גם להיות מודע לשינויים באזור תלוי. למרות שגירוי חוש המישוש במהלך התפתחות גידול במורכבות דנדריטים בקליפת מוח הקדם חזיתית, זה לא מבטיח ששינויים מבניים מסוג זה יהיו ברורים בכל אזורי המוח. יתכן שהמורפולוגיה עצבית באזורי מוח אחרים, כגון קליפת המוח הקודקודית, תגיב באופן שונה לחלוטין לאותה החוויה. עם זאת, מאחר שהליך גירוי חוש המישוש מנוהל בקלות ואינו מהווה סיכון לצאצאים או סכרים, יש לו הפוטנציאל לשמש ככלי רב ערך למחקרים רבים שנועדו לשפר את הפיתוחאל תוצאות. עם כל כבוד לצביעת Golgi-קוקס של רקמת המוח, הצעדים הקריטיים להדמיה מוצלחת של תאים עצביים הם כדלקמן: 1) חייבת להיות זלוף נאות של המוח עם תמיסת מלח. זלוף לא נכון או לא מספיק של תוצאות רקמת המוח בחפצי כלי דם זה עושים את זה קשה לדמיין בעצם תאים עצביים במבוך של כלי דם, בעוד שמסבך את היכולת לצלם נוירונים צבעוניים גם. 2) מוח perfused צריך להיות מאוחסן בפתרון Golgi-קוקס ותמיסת סוכרוז בחושך. אחסון רקמת המוח בחושך מפחית את מכתים הרקע של הרקמה, שוב מגדיל את הסיכוי להמחשה בהצלחה תאים עצביים איכות. 3) רקמת המוח מאוחסנת בתמיסת סוכרוז הבאה אחסון 14 היום בפתרון Golgi-קוקס. כאשר הרקמה היא שקועה בפתרון סוכרוז 30% ל2-5 ימים, המוח הוא גמישים יותר המונע מתנפץ וקריעה של חלקים כאשרחיתוך. זה חשוב כדי למנוע מרקמת המוח שנותר בתמיסת סוכרוז לפרקי זמן מוגבר (אלא אם כן פתרון סוכרוז מוחלף ברציפות עם פתרון טרי), כי אחסון ממושך בסוכרוז מפחית את האיכות מכתים. 4) לבסוף, לאחר שקופיות כבר מוכתמות וכיסוי החליק, הם צריכים לתת מספיק זמן לייבוש לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ. אם שקופיות אינן רשאים ישודרו כראוי יבש, הרקמה עלולה להכהות, הפחתת הדמיה מוצלחת של תאי עצב בקליפת המוח. שינויים יציבים בתפקוד פסיכולוגי ותגובות התנהגותיות המתרחשים בתגובה לחוויות הם האמינו להיות בהנחייתם של ארגון מחדש של מורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית 17. שינויים המבניים אלה מספקים משאבים למדידה לפלסטיות חוויה תלויה, השימוש בהליך מכתים אמין הוא חשוב. הליך מכתים Golgi-קוקס מבוסס vibratome זה מספק כתם אמיןing של ענפים דקים וקוצים הדנדריטים שלא יכול להיות ברור עם פרוטוקולים אחרים כגון celloidin-הטבעה. ייחודו של הליך Golgi-קוקס נובע מיכולתה כדי להכתים חלק קטן של אלמנטים עצביים (1-10%), המאפשר איתור של נוירונים בודדים למרחקים ארוכים בלבד. על אף העובדה שרק חלק קטן של הנוירונים ספוגים עם הכתם, תאים הניתנים לעין, לשמור על כל התכונות, כולל גוף תא, דנדריטים, קוצים הדנדריטים ואקסונים. יתר על כן, כאשר ההליך מכתים מתבצע בצורה נכונה, התאים המוכתמים להתבלט באופן ברור ומובהק על רקע שקוף, משום שמבנים בקליפת המוח אחרים יישארו ללא רבב ושקוף. בשל ההבנה ששינויים מתמשכים בתפקוד חיצוני חייבים להיות קשורים לפלסטיות של מערכת העצבים, כלומר היכולת של תאי עצב כדי לשנות את המבנה והקישוריות שלהם, ההליך מכתים Golgi-קוקס מספק לחוקריםטכניקה אמינה לחזות ולכמת פלסטיות זה.

אמנם יש טכניקות רבות דיווחו ומנוצלות לבחינת חוויות שליליות בשלב מוקדם הבשלת המוח, כגון מתח סביב הלידה 1,2, חסך חושי 3, ורעילויות תרופת 4, יש מעט מאוד מתודולוגיות המועסקות כדי לבחון את ההשפעות של חוויות חיוביות ב פרק זמן זה. מלבד העשרה סביבתית, גירוי חוש המישוש הוא אחד מכמה מוח שיפור טיפולים עם אפקטים הפגינו 5. גירוי חוש המישוש הוא שיטה של ​​גירוי חושי לעור המחקה את התנהגות החולדה האימהית, מלקק וטיפוח. הקבלה הכללית שלה כמניפולציה חיובית העולה ממחקרים המראים כי גירוי חוש המישוש השתפר הבשלה של פגים וחולדות שזה עתה נולדו 6. בנוסף, מחקר במעבדה מייני 7 הוכיח כי רמות גבוהות יותר של ליקוק וטיפוח אימהיים צמודות לתוצאות חיוביות בצאצאים. בשל tהשפעות חיוביות hese, גירוי חוש המישוש התפתחו במהירות לתוך אסטרטגיה מתקנת שמטרתה הפחתת חרדה 8, שיפור תוצאות הקשורים לפגיעה מוחית 9-11, והפחתת רגישות לסמים 12. ככזה, גירוי חוש המישוש הוא טכניקה רבת ערך לקידום חוויות מוקדמות חיוביות, עם יכולת מוכחת לארגון מחדש של מורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית של המוח המתפתח באופן דרמטי. על מנת לבחון ולכמת את השינויים במורפולוגיה עצבית, יש צורך לדמיין נוירונים בשלמותה. ההליך מכתים Golgi-קוקס הוא שינוי של הטכניקה של קמילו גולג&#39;י שפורסמה בסוף 1800s המספקת צביעה של מספר קטן של תאי עצב מלאים 13 בדידה. למרות ההליך מופיע להכתים נוירונים באקראי והשחזור מצוטט בכינויו פגם עיקרי, ההדמיה היתרי שיעור הספגה הקטנה של המרכיב העצבי כולה, כוללים לסה&quot;נגופי ll, דנדריטים, קוצים הדנדריטים, ואקסונים. באופן דומה, את הזמן הנדרש כדי להספיג מוח נתון עם פתרון Golgi גם צוטט כנפילה. עם זאת, בהתחשב בכך שפעם אחת הצביעה היא רקמה שלמה יכולה להישמר ללא הגבלת זמן, ואת הזמן בין טפטוף של המוח וההדמיה של הנוירונים במיקרוסקופ ניתן להשלים בתוך פחות מ21 ימים, תקופת הזמן היא לא בלתי סבירה. בנוסף, עם שינויים קלים בפרוטוקול, מכתים Golgi-קוקס ניתן להשתמש ביעילות כדי להספיג מוחם של מכרסמים מכל הגילאים. כמו שינויים ברמה המבנית נמצאו קשורים לשינויים מתמשכים לתפקוד ההתנהגותי ופסיכולוגי, את טכניקת צביעת Golgi-קוקס מספקת חוקרים עם כלי רב ערך כדי למדוד neuroplasticity.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dichromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercuric Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1561</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak Rapid Fix</td>
			<td>Vistek</td>
			<td>Kodak 146 4016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH-95 &amp; Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>No Cat Numbers</td>
			<td>All other Et-OH are dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td>
			<td>Safeway</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Can be found at most grocery stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemoDe</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>23410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Sp15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-365</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>062011-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining

כדי ליצור שינויים ארוך טווח בהתנהגות, חוויות חייבים להיות הפקת שינויים יציבים במורפולוגיה עצבית וקישוריות הסינפטית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה ראשונית חיובית שמחק אימהית ללקק וטיפוח בחולדה. חשיפת גורי חולדה לחוויה חיובית זה יכול להסתיים בקלות וביעילות על ידי שימוש בחומרים נגישים מאוד כגון מטלית משק בית. באמצעות עיצוב המלטה צולבת, גורים הם ליטפו אחד או שמאלה באין מפריע, במשך 15 דקות, שלוש פעמים ביום לאורך כל התקופה סביב הלידה. כדי למדוד את שינויי neuroplastic הקשורים לניסיון המוקדם החיובי הזה, מכתים Golgi-קוקס של רקמת המוח מנוצל. בשל העובדה שהספגת Golgi-קוקס מכתימה מספר בדיד של נוירונים ולא כל התאים, מכתים של המוח המכרסם עם פתרון Golgi-קוקס מאפשר ההדמיה של אלמנטים עצביים כולה, ובכלל זה גוף התא, דנדריטים, אקסונים, ו קוצים הדנדריטים. I ההליך מכתיםים שבוצע על פני כמה ימים ודורש שהחוקר לשים לב לפרטים. עם זאת, ברגע שמכתים הושלם, כולו המוח כבר ספוג ויכול להישמר לזמן בלתי מוגבל לניתוח מתמשך. לכן, מכתים Golgi-קוקס הוא משאב יקר ערך לחקר פלסטיות חוויה תלויה.

כאשר הליך מכתים זה כבר אחרי כראוי, מכתים עקבי ואחיד של דנדריטים וקוצים שנוצר. ראה איור 1 עבור ייצוג של מכתים עצבי Golgi-קוקס. הליך זה מייצר כתמים כי ניתן להשוות להדמיה חדשה שפותחה בשיטות מבחנה ורשאית להתיר השדות דנדריטים שהטבעת הרקמה הבאה רציף. הטכניקה מבוססת vibratome עבור מכתים Golgi-קוקס כבר מצאה לייצר כתמים נרחבים יותר של סניפי מסוף ונוירונים פירמידליים, מאשר צביעה עם או מוטבע celloidin ורקמות מחולקים cryostat, 15. יתר על כן, מכיוון ששיטה זו של מכתים מכניסה את המוח כולו, ניתן לנתח את כל החלקים או מייד או בעתיד. כמיקום של שינוי מורפולוגי הוא שזה לא תמיד מובן מאליו בעת יצירת השערה מקורית, תהליך זה מאפשר הבדיקה של אזורי מוח נוספיםד מונע סילוק של רקמה שעשויה להיות שימושיים בעתיד. שיטת צביעה זו יכולה לשמש עבור מכתים אמין של כל מוחות בני חולדה (גיל P0-ישן). עם זאת, כאשר מכתימים את המוחות צעירים (&lt;1 גרם), המוח צריך להישאר רק בפתרון Golgi-קוקס במשך 6 ימים, ולא 14 הימים מומלצים למוחות בוגרים, כל ההליכים האחרים נשארים קבועים. הקושי העיקרי שעשויות להיות נתקלים במהלך תהליך צביעת Golgi-קוקס הזה הוא חוסר היכולת לייצר צביעה באיכות גבוהה של אזורים במוח מרכזיים, ובם התלמוס. כמו כל המוח הוא ספוג באותו הזמן, אזורים מרכזיים עשויים שלא לקבל ריכוזים אידיאליים של כתם. למרות ממצא זה, טכניקת Golgi-קוקס מייצרת כתמים חריגים של אזורים קורטיקליים כגון ההיפוקמפוס וסטריאטום. מגבלה סופית של ההליך נובעת מהסרת חלקית של דם מהמוח במהלך תהליך זלוף. דם עשוי לייצר חפצים ברקמת המוחזה עושה את זה קשה לצלם ולאתר את תאי העצב. טכניקות צביעת Golgi-קוקס מספקות מדד אמין של מורפולוגיה הדנדריטים וneuroanatomy כי הוא שימושי עבור מגוון רחב של מחקרים שנועדו לבחון את השינויים ברמה העצבית. כאשר בוחנים מבנה עצבי בקליפת מוח הקדם חזיתית בעקבות גירוי מישוש בתקופה המוקדמת שלאחר הלידה, מכתים Golgi-קוקס חשף עלייה דרמטית במורכבות הדנדריטים. שינויים אנטומיים הקשורים לגירוי חוש המישוש המוקדם ניתן להדגים באופן חזותי על ידי השוואת צפיפות עמוד השדרה של נוירונים פירמידליים מעכברוש שליטה לפירמידת נוירונים מעכברים שעברו גירוי חוש המישוש (ראה איור 1). כמו כן, ניתן לחשב פרמטרים כגון arborization הדנדריטים, אורך הדנדריטים, וצפיפות עמוד השדרה וסטטיסטית נותחו כדי להפיק נתונים רציפים הניתנים להשוואה על פני בעלי חיים. כדי להפיק תוצאות אמינות, ניתוח צריכה להתבצע בבוקרinimum של שלושה בעלי חיים לקבוצת טיפול וכחמישה נוירונים לאונה צריך להיות נבחר באופן אקראי לכל אזור במוח מתחת לניתוח. איור 2 מדגים את המורכבות דנדריטים (קוצים / מיקרומטר x מיקרומטר של דנדריט) של חיות שקיבלו גירוי ובעלי חיים שלא מישוש . בשני שדות הפסגה וbasilar של הנוירונים ניתחו מmPFC (CG3), גירוי חוש המישוש הביא לריבוי של פרמטרים עצביים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> איור 1. תמונת א &#39;הנציג של Golgi-קוקס מוכתם נוירון פירמידלי מהשכבה III של אזור CG3 בחולדה שקיבלה גירוי חוש המישוש במהלך פיתוח. ב נציג מוגדל תצלום (1,000 X) של קוצים הדנדריטים על דנדריטים הטרמינל בשדה basilar של CG3 ; התמונה בהירה יותר בצד השמאל היא לעכברים בקבוצת הביקורת ותמונה הכהה יותר על ריght הוא מעכברים שקיבלו גירוי חוש המישוש. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג להמחשה המורכבות הממוצעת הפסגה וbasilar דנדריטים (קוצים / מיקרומטר x מיקרומטר) לנוירונים באזור CG3 מחולדות מבוגרים שגם קיבלו גירוי חוש המישוש במהלך פיתוח או לא (* p &lt;0.01).

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining at JoVE

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

לדמיין את ההשפעות של ניסיון מוקדם חיובי, מישוש גירוי, על דנדריטים מורפולוגיה וSynaptic קישוריות עם Golgi-קוקס מכתים

מאמר זה מתאר את הנהלים לגירוי חוש המישוש של גורי חולדה ומכתים Golgi-קוקס הבא של מורפולוגיה עצבית. גירוי חוש המישוש הוא חוויה חיובית כי הוא מנוהל בתקופה סביב הלידה על ידי מלטף את הגורים עם מטלית משק בית. מכתים Golgi-קוקס הוא הליך אמין המאפשר ההדמיה של כל הנוירונים.

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

המדינה תלות השפעות על TMS: מבט על התנהגות Phosphene מניע

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

ההשפעות של גירוי זרם חילופין טראנס על קליפת המוח המוטורית הראשי על-ידי גישה משולבת מקוון עם גירוי מגנטי טראנס

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...