Name: pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia
Uploaded: 2013-09-18T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia at JoVE.com

In-vivo-Bildgebung wurde mit dem IVIS Shared Resource an der University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30-CA046934 unterstützt). Durchflusszytometrie wurde in der Durchflusszytometrie Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30CA046934 unterstützt) durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (RO1CA137078 DKG) unterstützt. ABLS ist ein Fellow des Pediatric Scientist Entwicklungsprogramm, durch Zuschüsse von der American Academy of Pediatrics, der American Pediatric Society und der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850) unterstützt.

Alle Experimente mit Tieren folgten die von der Universität von Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt regulatorischen Standards. Die nachgewiesene Protokoll wurde von der University of Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Phospho-Protein-Western Blot <ol><li> Herstellung von Lysaten <ol><li> Kulturzelllinien, die den Rezeptor-Tyrosin-Kinase von Interesse exprimieren. Ernten der Zellen und die Platte 3-5 x 10 6 Z...

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	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics.+2010.">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+childhood+cancer.">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li><li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia:+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there?.">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?.</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li><li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult.">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li><li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias.">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li><li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43,+phosphatase+inhibition,+and+thiol+reactivity+as+model+systems.">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li><li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+anticancer+agents:+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li><li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts:+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission.">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).</li><li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions.">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li><li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro:+malignant+melanomas.">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li><li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development.">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li><li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia:+a+strategy+for+preclinical+modeling.">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li><li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li></ol>

Diese Handschrift beschreibt eine wirksame Strategie zur Evaluierung neuer Tyrosinkinase-Inhibitoren bei der Behandlung von akuter Leukämie. Mit diesem Ansatz, biochemischen und Anti-Leukämie-Aktivitäten werden zunächst in zellbasierten Assays in vitro Xenotransplantat-Modelle in vivo ausgewertet und dann. Immunoblot-Analyse wurde erfolgreich verwendet, um die Hemmung der Ziel Tyrosinkinase in Leukämiezellen nach der Behandlung mit TKI demonstrieren und direkt vergleichen die Wirksamkeit von mehre...

Akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern 1,2. Die Gesamtüberlebensrate für Kinder-B-Zelllinien-ALL (B-ALL) ist etwa 85%, aber spezifische biologische Subtypen, darunter T-Zelllinien-ALL (T-ALL), haben immer noch schlechtere Prognose auch mit den aktuellen Therapieprotokolle. Die weitere Behandlung des rezidivierten ALL bleibt eine Herausforderung 3. Obwohl die Mehrheit der erwachsenen Patienten mit akuter Leukämie eine Remission zu erreichen mit Up-Front-Chemotherapie leiden viele Patienten immer noch 4 Rückfall. Strom Chemotherapien bei der Behandlung von akuter Leukämie bekannt, um Toxizität assoziierten kurz-und langfristige Nebenwirkungen verursachen. Daher werden weniger toxische Therapien, die spezifisch auf Krebszellen mit minimaler Wirkung auf normales Gewebe stark benötigt. In den letzten Jahren wurde der Schwerpunkt auf der Entwicklung von neuen, molekular gezielte Wirkstoffe mit Spezifität für Krebszellen oft unter Verwendung von iterativen Chemie platziertmehrere Wirkstoffe, die dann verglichen und priorisiert werden müssen 5 zu erzeugen. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung der TKI für die Behandlung von akuter Leukämie, die für die Bewertung einer einzigen Verbindung oder zur direkten Vergleich mehrerer Verbindungen, um die Medikamentenentwicklung zu erleichtern verwendet werden kann. Die hier vorgestellten Verfahren besteht aus vier Schritten. Die erste biochemische (1) und Anti-Leukämie-(2)-Aktivitäten der Verbindung (en) sind in der Zellkultur untersucht, dann die Hemmung des Targets in Tiermodellen (3) bestätigt, und schließlich therapeutische Wirksamkeit des TKI (en) (4) in orthotopen Leukämie Xenotransplantatmodellen bestimmt. Für diese Untersuchungen ist es wichtig, relevante Zelllinien, die Vertreter der häufigsten biologischen Subtypen wählen. Zelllinien gewählt werden, die beide, ausdrücklich das Ziel, Interesse und fehlt das Ziel von Interesse, zu untersuchen, ob biologische Wirkungen med. sinddurch Hemmung der Ziel iated. Dies ist für die Entwicklung von kleinen Molekül-Inhibitoren, die Nebeneffekte, die für Anti-Tumor-Aktivität können besonders relevant. Es ist auch notwendig, um eine Zelllinie, die von der Ziel-zur funktionellen Wirkungen wie Proliferation oder Überleben zu wählen. Vorläufige Zielvalidierungsstudien (außerhalb des Umfangs dieses Artikels) mittels RNA-Interferenz-oder anderen spezifischen Mittel, um das Ziel zu hemmen, kann verwendet werden, um zielabhängigen Zelllinien zu identifizieren. Es ist auch wünschenswert, um Zelllinien, Maus-Xenotransplantaten, so daß Zellkulturergebnisse können mehr direkt übersetzt in in vivo Experimenten bilden können wählen. Zur Bewertung der biochemischen Aktivität von TKIs in Leukämie-Zellen vermittelt wird, kann eine Abnahme der Rezeptor-Phosphorylierung als Indikator der Hemmung Ziel verwendet werden. Western-Blot-Analyse oder ELISA-Assays können verwendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit und Spezifität von Antikörpern.Wenn Antikörper mit ausreichender Spezifität für das Ziel verfügbar sind, sind ELISA-Assays bevorzugt, da sie mehr quantitative und effizient sind. In Fällen, in denen Antikörper mit ausreichender Spezifität für ELISA nicht verfügbar sind, können Western-Blot-Analyse erforderlich sein. In diesem Fall kann die Immunpräzipitation von einer großen Menge an Lysat nützlich für die Detektion von Zielen, die in geringer Menge sind sein. Dieser Ansatz ist für die Messung von Phospho-Proteine, die eine kurze Halbwertszeit haben können, für schnelle Änderungen in der Signal in Reaktion auf Umweltreize ermöglichen besonders relevant. Einige phosphorylierte Proteine ​​sind extrem labil, wahrscheinlich als Ergebnis der Komplexbildung mit Phosphatasen. Für robuste und konsistente Detektion dieser phosphorylierten Proteine ​​kann es auch möglich sein, Zellen mit Pervanadat eine irreversible Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor 6 behandelt, um das Phospho-Protein vor der Herstellung ganzer Zellysate stabilisieren. Zubestimmen, ob biochemische Aktivität ergibt Antitumorwirkungen können zielabhängigen biologischen Prozesse in Zell-basierten Experimenten beobachtet werden. Für Leukämie-Zelllinien, kann Anti-Leukämie-Aktivität durch TKI vermittelt mit Koloniebildungstests in Methylcellulose oder Soft-Agar-7 durchgeführt beurteilt werden. Weichagar kann bevorzugt sein, da dies ein festes Medium, das eher für die Manipulation wenn wiederholte Behandlung mit TKI erforderlich ist. Während viele akute myloid Leukämie (AML) Zelllinien Kolonien in Soft-Agar zu bilden, werden die meisten ALLE Zelllinien nur bilden Kolonien in Methylcellulose, die ein halbfestes Medium ist. Obwohl es möglich ist, mittel-und / oder Methylcellulose in TKIs Kulturen zu aktualisieren, kann nur kleine Mengen verwendet und mit begrenzten Frequenz werden. Ebenso ist es schwieriger, in Methylcellulose-Kolonien ohne Unterbrechung färben. Vorläufige Studien sollte die Fähigkeit von geeigneten Zelllinien, Kolonien in Methylcellulose und / oder Soft-Agar-und T-Form zu definierener optimale Dichte von Zellen in Kultur, so dass Kolonien sich nicht überlappen und in ausreichender Anzahl, um statistisch (üblicherweise 50-200 Kolonien pro 35 mm-Platte) erhalten relevanten Daten. Während in-vitro-Assays sind robust und kostengünstig, und haben weniger ethischen Implikationen als ganze Tierversuche, Weiterentwicklung der therapeutischen Verbindungen erfordert Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit in Tiermodellen. Für die in vivo-Studien können menschliche akuten Leukämie-Zelllinien in orthotop NOD.Cg-Prkdc SCID transplantiert werden ich l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) Mäuse und TKI kann leicht durch Injektion oder orale Gabe verabreicht werden. Einige Zelllinien kann die Exposition von Mäusen NSG auf eine niedrige Zelllinie abhängige Dosis der Strahlung, um festzustellen, für Heterotransplantate erfordern, und in diesem Fall Mäuse können nicht tolerieren, ohne orale Gabe 5-10 Tage Erholungszeit nach der Bestrahlung. Dieses Manuskript beschreibt Generation der B-ALL und T-ALL-Heterotransplantate mitspezifische Zelllinien (697 und Jurkat) als Beispiele aber Xenotransplantaten in Mäusen NSG Verwendung einer großen Vielzahl von Zelllinien etabliert werden. In dem Fall, dass andere Zelllinien sind falls die Anforderung für die Bestrahlung, die optimale Anzahl von Zellen zu verpflanzen, und den Zeitpunkt der Entstehung und Progression Krankheit sollte experimentell bestimmt werden. Im Idealfall werden diese Modelle vollständiger Penetranz (jedes Tier transplantiert entwickelt Leukämie), konsistente Kinetik (Leukämie schreitet ähnlich bei allen Tieren) und eine angemessene Behandlungsfenster (idealerweise 20 bis 30 Tage zwischen Beginn der Behandlung und Entfernung aus der Studie aufgrund von Krankheit) haben . Die Anzahl der Zellen transplantiert erhöht werden, um kinetische Penetranz und Konsistenz zu verbessern oder verringert, um das Behandlungsfenster bei Bedarf zu verbessern. Zu bestimmen, ob TKI vermitteln Ziel-Hemmung in vivo werden die Proben von Mäusen mit Leukämie Xenotransplantaten nach der Behandlung mit TKI oder nur Fahrzeug gesammelt. Idealerweise sollte die Dosis eind Zeitplan der Verwaltung für diese Experimente werden von pharmakokinetischen Studien, die oft von kommerziellen Labors durchgeführt und sind nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels geführt werden kann. Wenn pharmakokinetischen Daten verfügbar sind, kann die Konzentration der Verbindung für eine effektive Ziel Hemmung in der Zellkultur und die maximale Konzentration im Serum nach einer Einzeldosis von TKI erforderlich verwendet, um eine Anfangsdosis für Tierversuche zu definieren. Pharmakokinetischen Studien können auch den Zeitpunkt der Probenentnahme nach der Behandlung informieren pharmakokinetische Studien und die Art der Verabreichung. Inhibition des Ziels in jeder betroffenen Organs bewertet werden, aber die meisten Gewebe, die leicht erhoben und verarbeitet werden, sind bevorzugt. Die meisten akuten Leukämie-Zelllinien zu etablieren in der Leber, Knochenmark, der Milz, dem peripheren Blut und dem Zentralnervensystem, obwohl die spezifischen Organe betroffen und das Ausmaß der Transplantation dieser Organe variiert zwischen den Modellen. Die hier vorgestellte Protokoll beurteilt phospho-Protein-Hemmung im Knochenmark mittels Western Blot-Analyse, aber soliden Organen kann einfacher sein, konsequent ernten und benötigen nur minimale oder keine Verarbeitung vor dem Einfrieren, so dass weniger Gelegenheit für den Abbau von Phosphor-Proteine ​​während der Probensammlung und-verarbeitung. Immunhistochemie kann auch verwendet werden, um solide Tumoren oder Organe von Leukämie betroffen bewerten. Schließlich wird die therapeutische Wirksamkeit des TKI (s) in orthotopen Leukämie-Xenograft-Modellen bestimmt. Aus diesen Untersuchungen kann der Zeitpunkt der Einleitung der Behandlung variiert werden, so dass Krankheit mehr oder weniger festgelegt. Die Behandlung kann unmittelbar nach der Transplantation für die ersten Studien beginnen und dann in nachfolgenden Studien verzögert, bis erhebliche Krankheitslast erkannt wird, um eine Diagnosebehandlungsmodell genauer anzunähern. Idealerweise haben diese Tiermodellen auch die Fähigkeit zur nicht-invasiven Messung der Krankheitsbelastung. Wir haben Verfahren für die Einführung der Firefly Lucifer optimiertase-Gen in Leukämie-Zelllinien mit Virus-ähnlichen Partikeln, so dass für nicht-invasive, Längsschnittanalyse der Krankheitsbeginn und Verlauf und Beurteilung der Krankheitslast im Knochenmark und soliden Organen. Entscheidend für diesen Ansatz ist die Verwendung von Luciferase-markierte monoklonale Zelllinien, um die Variabilität in der Entwicklung von Luciferase-exprimierenden Leukämie mit der Verwendung von polyklonalen Zellinien assoziiert zu verhindern, und ist nicht abhängig von der Behandlung mit einem TKI 8. Zusammengenommen können diese Schritte für die Bewertung eines einzelnen TKI oder zum direkten Vergleich und Einstufung der mehreren TKIs verwendet werden. Während die Protokolle hier vorgestellt werden, zielen auf die Entwicklung von TKI, können diese Methoden, um andere Ziele angepasst werden und Überlegungen für die Assay-Entwicklung beschrieben. Somit kann diese Strategie im weiteren Sinne der präklinischen Bewertung von molekular gezielte Wirkstoffe anwendbar zur Behandlung von akuter Leukämie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

Rezeptortyrosinkinasen sind bei der Entwicklung und Progression von vielen Krebsarten, einschließlich Leukämie und soliden Tumoren in Verbindung gebracht und sind attraktiv druggable therapeutische Ziele. Hier beschreiben wir eine effiziente Vier-Schritte-Strategie für die präklinische Bewertung von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) in der Behandlung der akuten Leukämie. Zunächst wird Western-Blot-Analyse verwendet, um die Ziel Inhibition in kultivierten Leukämiezellen zu bestätigen. Die funktionelle Aktivität wird dann unter Verwendung klonogene Assays in Methylcellulose oder Soft-Agar-Kulturen untersucht. Experimentelle Verbindungen, die Aktivität in Zellkulturassays zeigen, werden in vivo mit NOD-SCID-gamma (NSG) orthotop Mäusen mit menschlichen Leukämie-Zelllinien transplantiert ausgewertet. Erste In-vivo-Studien bewerten pharmakodynamische Zielhemmung in leukämischen Blasten aus dem Knochenmark isoliert. Dieser Ansatz wird verwendet, um die Dosis und Verabreichungsschema für eine effektive Zielsperre notwendig festzustellen,ion. Nachfolgende Studien bewerten die Wirksamkeit der TKI in vivo unter Verwendung von Luciferase exprimierenden Leukämiezellen, wodurch eine nicht-invasive Überwachung des Biolumineszenz Leukämie Belastung und Beurteilung der therapeutischen Reaktion unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem. Diese Strategie wurde in vitro und in vivo wirksam war zur Bewertung der TKI und kann zur Identifizierung von molekular gezielte Wirkstoffe mit therapeutischem Potential oder zum direkten Vergleich und Priorisierung von mehreren Verbindungen eingesetzt werden.

Die hier vorgestellten Untersuchungen bewertet die biochemischen und funktionellen Wirkungen von TKI vermittelt und kann verwendet werden, um neue Verbindungen, basierend auf dem Grad der Ziel Inhibierung in vitro und in vivo werden einstuft, Reduktion der Koloniebildung und Verzögerung Leukämogenese NSG in Mäusen mit Luciferase-transplantierten getaggt Leukämiezellen. Immunoblot-Analyse wurde verwendet, um die Hemmung der aktiven phosphorylierten Form des Zielproteins ...

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

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Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Forschung

Medizin

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

Einem orthotopen Blasentumor Modell und der Auswertung der intravesikalen Behandlung SÄRNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

Die Verwendung eines Low-Flow-Digital-Anästhesiesystem für Mäuse und Ratten

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Netzwerkanalyse von Foramen Ovale Elektrode Recordings in Resistente Temporallappen Epilepsie-Patienten

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Ein präklinisches Porcine-Modell der orthotopischen Herztransplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Präklinisches Modell der Herzspende nach Kreislauftod

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...