Name: pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia
Uploaded: 2013-09-18T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia at JoVE.com

In vivo imaging was performed using the IVIS Shared Resource at the University of Colorado Cancer Center (supported by grant P30-CA046934). Flow cytometry was performed at the Flow Cytometry Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (supported by grant P30CA046934). This work was supported in part by the National Institutes of Health (RO1CA137078 to DKG). ABLS is a Fellow of the Pediatric Scientist Development Program, supported by grants from the American Academy of Pediatrics, the American Pediatric Society, and the Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850).

All experiments involving animals followed the regulatory standards approved by the University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee. The demonstrated protocol was approved by the University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Phospho-protein Western Blot
<ol>
	<li>Preparation of lysates
	<ol>
		<li>Culture cell lines expressing the receptor tyrosine kinase of interest. Harvest cells and plate 3-5 x 106 cells/sample in 400 &#956;l growth m...

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics.+2010.">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+childhood+cancer.">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li><li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia:+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there?.">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?.</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li><li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult.">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li><li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias.">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li><li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43,+phosphatase+inhibition,+and+thiol+reactivity+as+model+systems.">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li><li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+anticancer+agents:+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li><li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts:+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission.">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).</li><li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions.">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li><li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro:+malignant+melanomas.">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li><li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development.">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li><li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia:+a+strategy+for+preclinical+modeling.">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li><li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li></ol>

This manuscript describes an effective strategy for evaluation of novel tyrosine kinase inhibitors in the treatment of acute leukemia. Using this approach, biochemical and anti-leukemia activities are evaluated first in cell-based assays in vitro and then in xenograft models in vivo. Immunoblot analysis was successfully utilized to demonstrate inhibition of the target tyrosine kinase in leukemia cells after treatment with TKIs and to directly compare the potency of multiple compounds in cells. In the pr...

Akut lymfoblastisk leukemi (ALL) är den vanligaste maligniteten hos barn 1,2. Den totala överlevnaden för pediatrisk B-härstamning ALL (B-ALL) är ca 85%, men specifika biologiska undertyper, inklusive T-härstamning ALL (T-ALL), har fortfarande sämre prognos även med nuvarande behandlingsprotokoll. Ytterligare behandling av återfall ALLT är fortfarande en utmaning 3. Trots att majoriteten av vuxna patienter med akut leukemi uppnå en eftergift med up-front kemoterapi, många patienter fortfarande lider återfall 4. Aktuella kemoterapeutiska behandlingar vid behandling av akut leukemi är kända för att orsaka toxicitet associerad kort och långsiktiga biverkningar. Därför finns ett stort behov mindre giftiga behandlingar som specifikt till cancerceller med minimal påverkan på normal vävnad. Under senare år har tonvikten lagts på utveckling av nya, molekylärt riktade medel med specificitet för cancerceller, ofta använder iterativ kemiatt generera flera aktiva föreningar, vilka sedan skall jämföras och prioriterade 5. Detta manuskript beskriver en effektiv strategi för pre-klinisk utvärdering av TKI för behandling av akut leukemi, vilket kan användas för utvärdering av en enda förening eller för direkt jämförelse av flera föreningar för att underlätta utveckling av läkemedel. Den metod som presenteras här består av fyra steg. Först den biokemiska (1) och anti-leukemi (2) verksamhet förening (ar) utvärderas i cellkultur, då hämning av målet bekräftas i djurmodeller (3), och slutligen terapeutisk effekt av TKI (er) bestämmes i orthotopic leukemi xenograft-modeller (4). För dessa studier är det viktigt att välja relevanta cellinjer, som är representanter för de vanligaste biologiska subtyper. Cellinjer bör väljas, som båda uttrycker målet av intresse och saknar målet av intresse, för att undersöka om biologiska effekter Mediated genom inhibering av målet. Detta är särskilt relevant för utveckling av småmolekylära hämmare, som har ej åsyftade effekter som kan vara viktiga för antitumöraktivitet. Det är även nödvändigt att välja en cellinje som är beroende av målet för funktionella effekter såsom proliferation eller överlevnad. Preliminära validerings mål studier (utanför ramen för denna artikel) med hjälp av RNA-interferens eller andra särskilda medel för att hämma målet kan användas för att identifiera mål beroende cellinjer. Det är också önskvärt att välja cellinjer som kan bilda murina xenografter, så att cellkulturresultat kan vara mer direkt översättas till in vivo-experiment. För utvärdering av biokemisk aktivitet förmedlad av TKI i leukemiceller, kan en minskning av receptor-fosforylering används som en indikator på mål-hämning. Western blot-analys eller ELISA-analyser kan användas, beroende på tillgänglighet och specificitet av antikroppar.Om antikroppar med tillräcklig specificitet för målet är tillgängliga, ELISA-analyser är att föredra eftersom de är mer kvantitativ och effektiv. I de fall där antikroppar med tillräcklig specificitet för ELISA inte är tillgängliga, kan Western blöt-analys vara nödvändig. I detta fall kan immunoutfällning av en stor mängd av lysat vara användbara för detektering av mål som är i begränsad omfattning. Detta tillvägagångssätt är särskilt relevant för mätning av fosfonotio-proteiner, som kan ha en kort halveringstid för att möjliggöra snabba förändringar i signalering som svar på stimuli från omgivningen. Vissa fosforylerade proteiner är extremt labila, troligen till följd av komplexbildning med fosfataser. För robust och konsekvent detektering av dessa fosforylerade proteiner, kan det också vara möjligt att behandla cellerna med pervanadat, en irreversibel protein-tyrosin-fosfatas-inhibitor 6, för att stabilisera den fosfo-protein före preparation av helcellslysat. Tillbestämma huruvida biokemisk aktivitet resulterar i anti-tumöreffekter, kan riktberoende biologiska processer övervakas i cellbaserade försök. För leukemicellinjer, kan anti-leukemia aktivitet förmedlas av TKI bedömas med hjälp av kolonibildningsanalyser utförda i metylcellulosa eller mjuk agar 7. Mjuk agar kan vara att föredra eftersom detta är ett fast medium som är mer mottaglig för manipulation, om upprepad behandling med en TKI är nödvändig. Medan många akuta myloid leukemi (AML)-cellinjer kommer att bilda kolonier i mjuk agar, kommer de flesta ALLA cellinjer endast bilda kolonier i metylcellulosa, som är ett halvfast medium. Fastän det är möjligt att uppdatera medellång och / eller TKI i metylcellulosa kulturer, kan endast små volymer att användas och med begränsad frekvens. På samma sätt är det svårare att färga kolonier utan att störa dem i metylcellulosa. Preliminära studier bör definiera förmågan hos lämpliga cellinjer för att bilda kolonier i metylcellulosa och / eller mjuk agar och tHan optimal täthet av celler i odling så att kolonier är icke-överlappande och i tillräckligt antal för att få statistiskt relevanta uppgifter (vanligen 50 till 200 kolonier per 35 mm platta). Även om in vitro analyser är robusta och kostnadseffektiva, och har färre etiska implikationer än hela djurförsök, utveckling av terapeutiska föreningar kräver bevis på effekt och säkerhet i djurmodeller. För in vivo-studier kan akuta leukemicellinjer skall ortotopiskt transplanteras in NOD.Cg-Prkdc scid jag l2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) möss och TKI lätt kan administreras genom injektion eller oral sondmatning. Vissa cellinjer kan kräva exponering av NSG möss till en låg cellinje-beroende dos av strålning för att xenotransplantat att fastställa, och i detta fall möss kan inte tolerera oral sondmatning utan en 5-10 dagars återhämtningsperiod efter bestrålning. Detta manuskript beskriver generering av B-ALL och T-ALL xenografts använderspecifika cellinjer (697 och Jurkat) som exempel men xenografter kan fastställas i NSG möss med hjälp av en mängd olika cellinjer. I händelse av att andra cellinjer är mer tillämpliga, kravet för bestrålning, optimala antalet celler för transplantation, och tidpunkten för sjukdomens uppkomst och progression bör bestämmas experimentellt. Helst ska dessa modeller har fullständig penetrans (varje djur transplanteras utvecklar leukemi), konsekventa kinetik (leukemi fortskrider på samma sätt i alla djur), och en rimlig fönster behandling (helst 20-30 dagar mellan påbörjad behandling och avlägsnande från studien på grund av sjukdom) . Antalet celler transplanterade kan ökas för att förbättra penetrans och kinetisk konsistens eller minskas för att förbättra behandlingsfönstret vid behov. För att avgöra om TKI medla mål hämning in vivo, tas blodprov från möss med leukemi xenografter efter behandling med TKI eller bara fordon. Helst dosen end administreringsschema för dessa experiment styrs av farmakokinetiska studier, som ofta kan utföras av kommersiella laboratorier och ligger utanför ramen för denna artikel. Om farmakokinetiska data finns tillgängliga, kan koncentrationen av föreningen som krävs för en effektiv mål-hämning i cellkultur och den maximala koncentrationen i serum efter en engångsdos av TKI användas för att definiera en startdos för djurstudier. Farmakokinetiska studier kan också informera tidpunkten för provinsamling efterbehandling för farmakodynamiska studier och administrationsvägen. Hämning av målet kan bedömas i alla drabbade organ men vävnader som är lättast att samlas in och behandlas är att föredra. Mest akut leukemi cellinjer etablera i lever, benmärg, mjälte, perifert blod, och det centrala nervsystemet, även om de särskilda organ som påverkas och omfattningen av engraftment i dessa organ varierar mellan modellerna. Protokollet presenteras här bedömer fosfo-protein inhibition i benmärg med hjälp av Western blot-analys, men fasta organ kan vara lättare att konsekvent skörda och kräver minimal eller ingen behandling före frysning, vilket gör att mindre möjlighet till nedbrytning av fosfonotio-proteiner under insamling och bearbetning prov. Immunohistokemi kan också användas för att utvärdera solida tumörer eller organ som drabbats av leukemi. Slutligen är den terapeutiska effektiviteten av TKI (er) bestämmas i orthotopic leukemi xenograft-modeller. För dessa studier, kan tidpunkten för behandlingsstart varieras, så att sjukdomen är mer eller mindre etablerade. Behandlingen kan påbörjas omedelbart efter transplantation för inledande studier och därefter fördröjas i senare studier tills börda betydande sjukdomen upptäcks att närmare approximera ett diagnostiskt behandlingsmodell. Helst dessa djurmodeller har också kapacitet för icke-invasiv mätning av sjukdomsbördan. Vi har optimerat metoder för införande av eldfluga luciferase gen i leukemicellinjer använder virusliknande partiklar, vilket möjliggör icke-invasiv, longitudinell analys av sjukdoms uppkomsten och utvecklingen och bedömning av sjukdomsbördan i benmärgen och fasta organ. Kritiskt för detta tillvägagångssätt är användningen av monoklonala luciferas-taggade cellinjer för att förhindra variationer i utvecklingen av luciferas-uttryckande leukemi i samband med användning av polyklonala cellinjer och har inget samband med behandling med en TKI 8. Sammantaget kan dessa steg kan användas för utvärdering av en enda TKI eller för direkt jämförelse och rangordning av flera TKI. Medan de protokoll som presenteras här fokuserar på utveckling av TKI, kan dessa metoder anpassas till andra mål och överväganden för analysutveckling beskrivs. Således kan denna strategi vara mer allmänt tillämpas på preklinisk utvärdering av molekylärt inriktade medel för behandling av akut leukemi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

Receptortyrosinkinaser har implicerats i utvecklingen och progressionen av många cancerformer, inklusive både leukemi och solida tumörer, och är attraktiva druggable terapeutiska mål. Här beskriver vi en effektiv fyra steg strategi för pre-klinisk utvärdering av tyrosinkinashämmare (TKIs) vid behandling av akut leukemi. Inledningsvis är western blot-analys som används för att bekräfta målet inhibition i odlade leukemiceller. Funktionell aktivitet utvärderas sedan med hjälp av klonogena analyser i metylcellulosa eller mjuka agarodlingar. Experimentella föreningar som visar aktivitet i cellkulturanalyser utvärderas in vivo med hjälp av NOD-SCID-gamma (NSG) möss transplanteras orthotopically med leukemicellinjer. Initiala in vivo farmakodynamiska studier utvärdera mål inhibering i leukemiska blaster isolerade från benmärgen. Denna metod används för att bestämma dos och schema för administration som krävs för en effektiv mål spärrjon. Efterföljande studier utvärdera effekten av TKI in vivo med hjälp av luciferas uttrycka leukemiceller, vilket gör det möjligt för icke-invasiv självlysande övervakning av leukemi börda och bedömning av terapeutiskt svar med hjälp av en in vivo mareld imaging system. Denna strategi har varit effektiv för utvärdering av TKI in vitro och in vivo och kan användas för identifiering av molekylärt inriktade agenter med terapeutisk potential eller för direkt jämförelse och prioritering av flera föreningar.

The assays presented here evaluate the biochemical and functional effects mediated by TKIs and can be used to rank novel compounds based on the degree of target inhibition in vitro and in vivo, reduction of colony formation, and delay in leukemogenesis in NSG mice transplanted with luciferase-tagged leukemia cells.
Immunoblot analysis was utilized to determine inhibition of the active phosphorylated form of the target protein in leukemia cells following treatment with TKIs. T...

Watch this Scientific Journal Video about Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia at JoVE.com

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Preklinisk utvärdering av tyrosinkinashämmare för behandling av akut leukemi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Användning av farmakologisk-utmaning fMRI i Pre-klinisk forskning: Ansökan till 5-HT-systemet

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

En ortotopisk blåstumör modell och utvärdering av Intravesikal Sarna behandling

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Kvantitativ Multispectral Analys Efter Lysrör Tissue Trans för visualisering av Cell Origins, typer, och interaktioner

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Hantering av Cotton Rat i studier för Preklinisk utvärdering av onkolytisk virus

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

Preklinisk Orthotopic musmodell av human prostatacancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

Användning av en låg flödes Digital anestesisystemet för möss och råttor

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akut retinal modell för utvärdering Blood Retinal Barrier överträdelse och potentiella läkemedel för behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

En preklinisk porcin modell av ortotopisk hjärt transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Preklinisk modell av hjärt donation efter cirkulatorisk död

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Invasiv hemodynamisk bedömning för det högra ventrikulär systemet och Hypoxiinducerad pulmonell arteriell hypertension hos möss

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...