Name: total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species
Uploaded: 2013-10-15T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en studieplass fra The University of British Columbia (til BV) og tilskudd fra Cystisk Fibrose Canada og kanadiske Institutes of Health Research (til DPS). Vi takker Jacqueline Chung for den første utarbeidelse av protokoller.

En. Kultur Vekst (Days 1 +2) <ol><li> Dyrk en startkultur: 3 ml Luria Bertani (LB) buljong i en smekk topp 15 ml tube, ved 37 ° C rotator over natten. Tynn ut over natten vekst til en OD 600 på 0,6. Tilsett 1 ml av denne fortynning til 100 ml LB-næringsløsning i en 250 ml Erlenmeyer kolbe. Inkuber ved 37 ° C med rysting ved 250 rpm i 16 timer inn i stasjonær fase (SP), for å bedre nøyaktig, i batch-kultur, infeksjonsforhold, og for å sikre at bakteriell virulens faktorer under kontroll av stasjonæ...

<ol>
	<li>Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia+in+cystic+fibrosis:+epidemiology+and+molecular+mechanisms+of+virulence.">Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).</li><li>Suarez-Moreno, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Environmental+and+Potentially+Beneficial+Plant-Associated+Burkholderia.">Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia.</a> Microb. Ecol. , (2011).</li><li>Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melioidosis:+insights+into+the+pathogenicity+of+Burkholderia+pseudomallei.">Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).</li><li>White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melioidosis.">Melioidosis.</a> Lancet. 361, 1715-1722 (2003).</li><li>Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifarious,+multireplicon+Burkholderia+cepacia+complex.">The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).</li><li>Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Burkholderia+cepacia+complex+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis.</a> Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).</li><li>Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+susceptibility+of+Pseudomonas+pseudomallei.+Emergence+of+resistance+in+vitro+and+during+treatment.">The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment.</a> J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).</li><li>Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+of+65+isolates+of+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+mallei+to+35+antimicrobial+agents.">Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).</li><li>Govan, J. R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transmission+of+Pseudomonas+cepacia+by+social+contact+in+cystic+fibrosis.">Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis.</a> Lancet. 342, 15-19 (1993).</li><li>Thongboonkerd, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proteome+in+Burkholderia+pseudomallei+rpoE+operon+knockout+mutant:+insights+into+mechanisms+of+rpoE+operon+in+stress+tolerance,+survival,+and+virulence.">Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence.</a> J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).</li><li>Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+B.+cenocepacia+using+two-dimensional+liquid+separations+coupled+with+mass+spectrometry.">Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry.</a> Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).</li><li>Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+profiles+and+the+potential+markers+between+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.+Mol.">Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol.</a> Cell Probes. 21, 81-91 (2007).</li><li>Harding, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+surface+proteins+of+Burkholderia+pseudomallei.">The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei.</a> Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).</li><li>Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+(2-D+DIGE)+reveals+molecular+strategies+employed+by+Burkholderia+cenocepacia+to+adapt+to+the+airways+of+cystic+fibrosis+patients+under+antimicrobial+therapy.">Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy.</a> Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).</li><li>Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Mucoidy+in+Virulence+of+Bacteria+from+the+Burkholderia+cepacia+Complex:+A+Systematic+Proteomic+and+Transcriptomic+Analysis.">The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis.</a> J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).</li><li>Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+proteome+of+Burkholderia+cenocepacia+H111:+setting+up+a+2-DE+reference+map.">Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map.</a> Proteomics. 6, 207-216 (2006).</li><li>Weiss, W., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+solublization+buffers+for+two-dimensional+electrophoresis.">Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).</li><li>von der Haar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+for+quantitative+proteomics+of+yeasts.">Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts.</a> PLoS One. 2, e1078 (2007).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+low-abundance+proteins+using+multidimensional+chromatography+and+isotope-coded+affinity+tags.">Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags.</a> J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Velapati&#241;o, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis.">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li><li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

En fremgangsmåte for proteiner Preparatet er beskrevet som kan trekke ut mesteparten av Burkholderia proteiner med god reproduserbarhet. Dette er demonstrert ved å skaffe den samme proteinprofilen fra to uavhengige preparater utført på forskjellige dager ved bruk av samme bakteriekultur dyrket i LB-eller YEM buljong, som vist i figur 1. Utvinning var effektiv for bakterier dyrkes i flytende medier, men vi har ikke testet denne metoden for bakterier dyrket på platene. Denne metoden ble ogs?...

Slekten Burkholderia omfatter mer enn 62 arter, Gram-negative organismer ble isolert fra en rekke nisjer, og den er delt i to hoved klynger 1,2. Den første klyngen omfatter mennesker, dyr og phytotrophic organismer, og de fleste studier har fokusert på de sykdomsfremkallende arter av denne gruppen på grunn av deres kliniske betydning. De mest patogene medlemmer er B. pseudomallei og B. mallei (som forårsaker melioidosis og glanders henholdsvis) 3,4 og opportunistiske patogener (de 17 definerte arter av Burkholderia cepacia kompleks, BCC) 5, som forårsaker sykdom hos cystisk fibrose (CF) og kronisk granulomatøs sykdom (CGD) en. Den andre klyngen, med mer enn 30 ikke-patogene arter, omfatter bakterier assosiert med planter eller med miljøet, og anses potensielt fordelaktig for verten 2.. Tallrike komplikasjoner dukker frOM bakteriell infeksjon med den patogene medlemmer av Burkholderia slekten, slik som overføring av organismen mellom pasienter, spredning av sykdommen og behandlingssvikt på grunn av den indre eller ervervet resistens mot antibiotika gjør vanskelig å utrydde i de fleste av tilfellene 6-9. Derfor få en klarere forståelse av grunnlaget for etablering av bakteriell infeksjon er viktig for behandling av sykdommer forårsaket av slike organismer. For å få innsikt i etablering av infeksjon, er omfattende undersøkelser på de bakterielle komponenter assosiert med patogenesen nødvendig. Studier som fokuserer på proteomikk analyser av Burkholderia organismer ved hjelp av proteomikk tilnærminger beskrevet proteiner som har vært innblandet i bakteriell patogenesen samt endringer i deres proteom profiler 10-16. Protein utvinning metoder ved hjelp av ultralydbehandling og fryse-tint sykluser i lysis buffer som inneholder høy konsentration av urea, har tiourinstoff i kombinasjon med vaskemiddel og ampholytes blitt anvendt i Burkholderia proteomikk studier 10-13. Selv urinstoff er ganske effektiv for proteindenaturering, kan den etablere en likevekt i vandig oppløsning med ammonium-isocyanat, som kan reagere med amino-syregrupper, for derved å danne gjenstander (karbamylering reaksjon) 17. Derfor anbefales det å inkludere bærer ampholytes, som fungerer som cyanat passiveringsmidler og unngå temperaturer høyere enn 37 ° C 17. Videre, for å forhindre en hvilken som helst kjemisk interferens av lysis buffer med protein kvantifisering, den samme lyseringsbuffer kan anvendes til å generere standardkurven, slik at prøvene og standardene har samme bakgrunn 10.. Andre metoder involverer bruken av alkaliske buffere og vaskemidler med varme inkubasjonsperioder 17,18, men disse betingelser kan indusere endringer i proteomet og enkelte vaskemidler er ikke kompatible med proteomics søknad med mindre senere fjernings vaskemiddel trinn er inkludert 17,18. Etter tilfredsstillende ekstraksjon og kvantifisering kan global protein ekspresjon av hvert enkelt protein bli studert ved hjelp proteomic tilnærminger som to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese. Denne teknikken ble først beskrevet av O&#39;Farell 19 og består i separasjonen av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, og deretter i henhold til deres molekylvekt ved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. På grunn av dets oppløsning og sensitivitet, er denne teknikken et kraftig verktøy for analyse og påvisning av proteiner fra komplekse biologiske kilder 19,20. Denne separasjonsteknikk er for tiden tilgjengelig i protein-sentriske tilnærminger med den store fordelen av å løse protein isoforms forårsaket av post-transcriptional modifikasjoner eller proteolytisk prosessering. Kvantitative endringerkan påvises ved å sammenligne intensiteten av den tilsvarende sted etter farging av gelen 20.. Imidlertid er denne teknikk ikke er egnet for identifisering av meget store proteiner, membranproteiner, ekstremt enkel og sure eller hydrofobe proteiner, og er en noe arbeidskrevende og tidskrevende teknikk 20.. Nye peptid-sentriske tilnærminger (ikke gel-basert) som er mer robust og objektiv blir tilgjengelige og kan benyttes for kvantitativ sammenligning av differensial stabile isotoper for merking av metoder som cystein merking av isotop-kodet affinitet merking (ICAT) 21, og aminogruppen merking av isotopen tagging for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) 22. Bruken av en enkelt proteomikk teknikk kan gi utilstrekkelig informasjon, og derfor bruken av to komplementære proteomic tilnærminger er nødvendig for de fleste fullstendig å vurdere endringer i proteom. Ikke desto mindre er 2-D-gel-elektroforese utbredt og kan rutinemessig anvendes for kvantitative uttrykket av flere proteiner i ulike organismer. Her beskriver vi en hel-celle protein utvinning og 2-D gel elektroforese prosedyrer for Burkholderia arter som ble tilpasset og optimalisert fra GE Healthcare 2-D elektroforese Prinsipper og metoder håndbok 80-6429-60AC 2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). Proteinet ekstraksjon ble utført ved hjelp av en limstreng beater med glasskuler i nærvær av PBS inneholdende 5 mM EDTA (etylendiamin-tetraeddiksyre), 1 mM PMSF (fenylmethyl-sulfonylfluorid). Denne prosedyren tillater kvantifisering av proteiner med minimal degradering og er amendable for proteomikk tilnærminger som tidligere rapportert 15,23,24. 2-D-gel-elektroforese ble utført ved å bruke 24 cm lang immobilisert pH 4-7 gradient og proteiner ble separert i henhold til deres isoelektriske punkt. Deretter proteiner ble separert i henhold til deres Molecmeringen vekt ved SDS-polyakrylamid-gel. I tillegg har vi beskrevet en sølvfargemetoden for visualisering av stikk proteiner, og en sølvfarge metode som er kompatibel for massespektrometri-analyse. Sammen disse prosedyrene kan tillate identifikasjon av viktige proteiner fra Burkholderia arter som kan være involvert i patogenesen.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

Undersøkelsen av de intracellulære protein-nivåer i bakterielle arter er av betydning for å forstå de patogene mekanismer av sykdommer forårsaket av slike organismer. Her beskriver vi en fremgangsmåte for protein-fjerning fra Burkholderia arter basert på mekanisk lysis ved hjelp av glasskuler i nærvær av etylendiamin-tetraeddiksyre og fenylmethyl-sulfonylfluorid i fosfatbufret saltvann. Denne metoden kan bli brukt for forskjellige Burkholderia arter, for forskjellige vekstbetingelser, og det er sannsynlig egnet for bruk i proteomic studier av andre bakterier. Etter protein ekstraksjon, er en to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese proteomikk teknikk som er beskrevet for å studere globale endringer i proteomes av disse organismene. Denne metoden består av separering av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, etterfulgt av separering på basis av molekylvektved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. Visualisering av separerte proteinene blir utført ved sølvfarging.

Sammenlignende analyse av proteinprofilene utvunnet fra den samme bakteriekultur på to forskjellige anledninger viste lignende mønstre banding indikerer suksessfulle protein ekstraksjoner. Molekylvekt proteiner utvunnet varierte 10-150 kDa. Figur 1 viser representant Coomassie blå flekker gel av de hel-celle protein utdrag fra Burkholderia multivorans (et medlem av BCC) kliniske isolater dyrket i LB eller gjær / mannitol (YEM) kjøttkraft og høstet fra stasjonær fase. <p class="jove_c...

Watch this Scientific Journal Video about Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species at JoVE.com

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totalt Protein Extraction og 2-D-gel-elektroforese Metoder<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

Medlemmer av Burkholderia slekten er patogener av klinisk betydning. Vi beskriver en fremgangsmåte for total bakterieprotein utvinning, ved hjelp av mekaniske forstyrrelser, og 2-D-gel-elektroforese etterfølgende proteomikk analyse.

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

En enkel Chelex Protocol for DNA-ekstraksjon fra<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp..

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

To metoder for Heterokaryon Dannelse å oppdage HCV Restriction faktorer

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Rutiner for å identifisere Smittsomme Prions Etter passasje gjennom fordøyelsessystemet til en fuglearter

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metoder for kvantitativ påvisning av antistoff-indusert komplementaktivering på røde blodlegemer

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infeksjon som en modell for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomikk Profilering av Makrofager av 2D elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro -metoder for fastsettelse av Viral kapsid konstruksjonssikkerhet

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Utvinning av Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobielle infeksjoner og analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...