Name: cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, France (au Dr Moreau), les Instituts de recherche en santé du Canada (Grant PP2-99466 Dr Moreau) et de quatrième dimension Spine LLC , New York, États-Unis (Bourse de recherche au Dr Moreau).

Toute la procédure est effectuée sous la hotte biologique stérile et toutes les solutions et les équipements entrant en contact avec les cellules doivent être stériles. Une. Préparation des solutions essentielles <ol><li> Préparer des solutions selon le tableau 1. </li><li> Conserver la solution saline équilibrée (BSS) à la température ambiante et toutes les autres solutions à 4 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;utilisation. </li><li> Médias froid au chaud à 37 ° C dans le bain d&#39;eau pendant quelques minutes avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 2. Préparation et stockage des PBMC <ol><li> Recueillir 10 ml de sang total dans des tubes de collecte traités à l&#39;EDTA pour préparer deux aliquotes de PBMC en utilisant 5 ml de chaque fraction aliquote. </li><li> Transférer 5 ml de sang entier à partir du tube de prélèvement sur EDTA à un tube de 50 ml. </li><li> Ajouter un volume égal de BSS et l&#39;échantillon mélanger par pipetage doux de haut en bas. </li><li> Placez 3 ml de Ficoll dans deux tubes de 15 ml Falcon. </li><li> Couche avec précaution 4,5 mlde mélange de sang dilué sur le Ficoll dans chaque tube. </li><li> Laissez reposer les tubes pendant 5 min pour favoriser une séparation claire du sang et de Ficoll. </li><li> Centrifuger les tubes à 400 g pendant 30 min à température ambiante, sans frein. </li><li> Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse afin de ne pas perturber la stratification. Les PBMC sont visibles à l&#39;interface BSS / Ficoll. </li><li> Récolter la couche nuageuse de PBMC à l&#39;interface de deux tubes avec une pipette et transférer dans un nouveau tube de 50 ml. </li><li> Ajouter 20 ml de milieu complet. </li><li> Centrifuger le tube à 288 g pendant 7 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de milieu supplémentaire. </li><li> Ajouter un volume égal de milieu de congélation. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube cryogénique. </li><li> Placer le tube cryogénique dans un récipient de cryocongélation avec de l&#39;isopropanol. </li><li> Entreposer le contenant congélation à -80 ° C pendant la nuit. </li><li> Transfer les PBMC congelés aliquote de l&#39;azote liquide pour le stockage à long terme. </li></ol> 3. Dosage fonctionnel Une. Jour 1 <ol><li> Placez aliquote de l&#39;azote liquide dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant une minute ou jusqu&#39;à ce que décongelé. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube de 50 ml avec une pipette stérile. </li><li> Ajouter 15 ml de milieu complet et les cellules tourner vers le bas à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Suspendre doucement culot cellulaire dans 1 ml de PHA médias. </li><li> Compléter le volume à 20 ml avec le même support. </li><li> Boucher le tube lâche pour laisser l&#39;air entrer. </li><li> Laisser le tube pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pour permettre lymphocytes calmes pour se transforment en lymphoblastes rapidement-prolifération. </li></ol> 2. Jour 2 <ol><li> Prenez le tube de l&#39;incubateur, visser les bouchons complètement et tourner les cellules vers le bas à 200 g pendant 5 minà la température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Suspendre doucement culot cellulaire dans 1 ml de milieu complet. </li><li> Compléter le volume à 20 ml avec le même support. </li><li> Boucher le tube lâche pour laisser l&#39;air entrer. </li><li> Laisser le tube pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pour étendre le nombre de cellules. </li></ol> 3. Jour 3 <ol><li> Obtenez le tube de l&#39;incubateur, visser les bouchons complètement et tourner les cellules vers le bas à 200 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant par aspiration. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 10 ml de RPMI-1640 par centrifugation à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension doucement le culot cellulaire dans 600 pi de milieu RPMI-1640. </li><li> Mesurer la concentration et la viabilité cellulaire, en utilisant un compteur de cellules automatisé et la viabilité analyseur. </li><li> Ajouter le volume approprié de milieu RPMI-1640 pour ajuster à une concentration cellulaire de 1,5 x 10 5 cellules/20 ul. </li&gt; <li> Traiter les cellules avec la protéine recombinante OPN (rOPN) ou de véhicule (PBS) dans 1,5 ml de tubes Eppendorf. <ol><li> Transférer 100 pl de suspension cellulaire dans deux tubes Eppendorf de 1,5 ml stériles. </li><li> Ajouter rOPN dans un tube à une concentration finale de 0,5 pg / ml. </li><li> Ajouter un volume égal de PBS dans le second tube. </li><li> Mélanger délicatement chaque condition par aspiration et à deux reprises en utilisant un ensemble de pipette stérile à 100 pi. </li></ol></li><li> Préparer le petit échantillon de 96 puits de microplaques. <ol><li> Ajouter 5 ul de RPMI-1640 à chaque puits. </li><li> Centrifuger la plaque à 200 g pendant 3 min pour éliminer les bulles d&#39;air. </li></ol></li><li> Ensemencer les cellules non traitées ainsi que des cellules traitées avec du PBS ou rOPN. <ol><li> Avant de transférer des cellules de tube pour microplaque, pipette doucement monter et descendre une fois pour assurer une suspension uniforme de cellules. </li><li> Ajouter 40 ul de suspension de cellules par puits en quatre exemplaires pour les cellules non traitées, en double exemplaire, pour rOPN PBS ou des cellules traitées. ReFer à la figure 1 pour la conception. Cette conception permet 12 patients à tester sur le même microplaque. </li><li> Laisser la plaque de cellule sous la hotte stérile pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se reposer et se déposent uniformément sur le fond du puits avant le placement dans l&#39;incubateur. </li></ol></li><li> Incuber la plaque pendant 18 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pour optimiser l&#39;effet de l&#39;OPN. </li></ol> 4. Jour 4 <ol><li> Exécutez la plaque avec des composés. <ol><li> Prenez la plaque de l&#39;incubateur et le laisser à température ambiante pendant environ 30 min. </li><li> Préparer 1 ml de 100 M de la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol dans RPMI-1640 en ajoutant 10 ul de la solution mère (10 mM) dans 990 pi de RPMI-1640. </li><li> Remplir la plaque de distribution composé de 20 ul dans les puits appropriés, comme indiqué sur la figure 2. </li><li> Couvrir la plaque avec un composé de joint d&#39;étanchéité pouvant être percé prédécoupée pour éviter un changement de la concentration en composé par évaporation avant d&#39;ou lors de l&#39;incubation dans le système basé sur le CDS. </li><li> plaque de charge de la cellule, des embouts de pipette et plaque de composé dans le système basé sur le CDS. </li><li> Nommez la plaque dans le logiciel de l&#39;appareil à base de CDS. </li><li> Sélectionnez le protocole approprié. Le protocole modifié pour la classification avec des PBMC est appelé «cellules agoniste non adhérentes petite planche de démonstration RT 15 min». Aller à la boîte de protocole et sélectionnez ce protocole dans la liste des protocoles </li><li> Initier le protocole en cliquant sur ​​&quot;Démarrer&quot;. </li><li> Le système fluidique intégré ajoute simultanément les composés à tous les puits en injectant de 5 ul par puits pour obtenir une concentration finale de 10 uM dans un volume total de 50 ul. </li><li> Le système basé sur CDS recueille automatiquement les données pendant 15 minutes après l&#39;addition de composé. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des données <ol><li> Sélectionnez gammes basses et hautes fréquences de à utiliser pour calculer les valeurs extraites de la nonles cellules adhérentes. </li><li> Sélectionnez la correction de dérive pour corriger la variation linéaire de mesures d&#39;impédance de base au fil du temps. </li><li> Sélectionner le filtrage des données pour réduire les variations de la mesure de la réponse cinétique due au bruit électronique et addition de composé. </li><li> Sélectionnez la méthode Max-Min pour le temps d&#39;analyse complet. </li><li> Exporter des données vers Excel vertu de l&#39;option de format de plaque. </li><li> Calculer delta G (AG) en soustrayant la moyenne de l&#39;amplitude de la réponse à la stimulation Gi (RmGi) à partir de la moyenne de l&#39;amplitude de la réponse à la stimulation Gs (RMG) à l&#39;aide de la formule suivante: AG = RmGi - RMG </li><li> Calculer le pourcentage de l&#39;effet de pliage (Fe) de l&#39;OPN sur la réponse à médiation par Gi en divisant la moyenne de la réponse amplitude de stimulation Gi en présence de l&#39;OPN (RmGiOPN) avec l&#39;amplitude moyenne de la réponse à la stimulation Gi en présence de PBS ( RmGiPBS) en utilisant la formule suivante: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Reportez-vous à Tmesure 2 pour classer les patients. </li></ol></li></ol>

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Ce travail a conduit à plusieurs brevets tenir par Hôpital Sainte-Justine de l&#39;Université et de nombreux autres sont en cours dans plusieurs pays. Quatrième Dimension Spine LLC est le licencié exclusif du CHU Sainte-Justine.

Nous avons décrit une procédure détaillée d&#39;un essai à base de cellules de pronostic pour la scoliose idiopathique qui est applicable à des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) fraîchement isolées ou conservé congelé pendant jusqu&#39;à un an dans de l&#39;azote liquide. Depuis l&#39;utilisation de PBMC fraîchement isolés est lourd lors de l&#39;essai grand nombre de personnes, la procédure a été présenté avec des PBMC congelés qui offrent une alternative plus pratique en milieu clinique. Cependant, des problèmes avec la cellule agglutination lors de la décongélation ont été rencontrées lors de PBMC congelés ont été initialement utilisées, conduisant parfois à la variabilité inter-essai. Pour maximiser la reproductibilité test, nous recommandons d&#39;éviter cycle gel-dégel et à l&#39;aide de l&#39;échantillon congelé une seule fois. La procédure est très simple, ce qui permet une détection précise de la fonction des protéines Gi défectueux dans un court laps de temps. En utilisant cette procédure, les enfants asymptomatiques et scoliotique peuvent être facilement classés de mieux prévoir l&#39;issue clinique sans danger pour leur santé. HoWever, lors de l&#39;exécution classification selon le degré de réponse maximum de Gi stimulation par rapport aux sujets témoins sains 12, plusieurs exigences pour les sujets de contrôle devrait être atteint. En effet, afin d&#39;avoir une cohorte de comparaison approprié, les sujets de contrôle doivent être âge et le sexe identifié, pas sur tout type de médicaments, et de fournir des renseignements personnels, tels que les antécédents médicaux particuliers / familiale. Ces exigences ne peuvent constituer un obstacle important pour le recrutement des sujets témoins. Par conséquent, effectuer une classification en examinant le degré de déséquilibre entre la réponse à Gs et Gi stimulation de la protéine chez le même individu est idéale pour éliminer la nécessité d&#39;utiliser des sujets témoins. L&#39;utilisation du système basé sur le CDS pour effectuer ce test pronostique est importante en termes de fournir simultanément Gi-réponses cellulaires et Gs médiation dans le même essai. Bien que de nombreux patients peuvent être classés sans hambiguïté en utilisant la gamme dynamique fixe pour ce test, un petit nombre de patients présentent des valeurs à la limite de gammes, comme illustré par les résultats du présent rapport. Pour distinguer ces personnes, nous avons introduit l&#39;évaluation de l&#39;effet de l&#39;OPN sur la réponse à la stimulation Gi en démontrant que OPN induit un effet différentiel sur la réponse cellulaire Gi-médiation entre les trois groupes fonctionnels. En effet, nous avons constaté que, en présence de l&#39;OPN, réponse à Gi stimulation augmente dans FG1, tandis qu&#39;elle diminue dans GR2 GR3 et, dans une plus large mesure dans FG2. Malgré le coût élevé de l&#39;OPN, l&#39;utilisation de cette chimiokine est essentiel de distinguer les cas ambigus, et donc d&#39;améliorer la précision de notre essai de classification. Toutefois, ce dosage présente un inconvénient en ce que un minimum de 1,5 x 10 5 cellules par puits est nécessaire pour observer la réponse cellulaire avec le système à base de CDS dans nos conditions expérimentales. Certains échantillons de patients n&#39;auront pas un nombre suffisant deles cellules à tester. Dans ce cas, il est nécessaire de rappeler les patients pour la collecte de sang supplémentaire, qui peut être inquiétant pour les familles et frustrant pour le personnel médical et de laboratoire. Des études prospectives sont prévues dans notre laboratoire pour résoudre ce problème. Néanmoins, le protocole actuel repose sur des méthodes simples et éprouvées pour préparer des cellules alors que le test est automatisé en utilisant un système validé sans étiquette 13, 14 pour surveiller les réponses des cellules. La plate-forme de test est relativement peu coûteux par rapport à la plate-forme génétique disponible pour le pronostic d&#39;autres maladies. En outre, le coût de tous les matériaux jetables, y compris les tubes de collecte de sang, des conseils, l&#39;électrode spéciale microplaques, et conique et tubes Eppendorf, n&#39;est pas très cher et est estimée à moins de 3000 $ pour effectuer un test pour environ un millier de patients. Bien que cette estimation ne comprend pas les coûts de main-d&#39;œuvre pour la préparation d&#39;échantillonset la réalisation du test, ce test reste beaucoup plus abordable que les plates-formes de séquençage de nouvelle génération. Il convient de noter, c&#39;est non seulement la comparaison des coûts de plates-formes génétiques, mais plus spécifiquement liées au domaine de l&#39;AIS, ce sont les coûts associés à l&#39;imagerie radiologique. Aujourd&#39;hui, plus d&#39;un million d&#39;enfants aux Etats-Unis et environ 100 000 enfants au Canada reçoivent un diagnostic de la scoliose idiopathique, et le coût total du diagnostic et le suivi des enfants scoliotiques par exposition aux rayons X est plus de 2,5 milliards de dollars par an en Amérique du Nord. Ainsi, on s&#39;attend à notre procédure de test à base de cellules pour être adapté pour le dépistage et le suivi des enfants atteints de scoliose idiopathique sans risque pour la santé et à moindre coût routine.

La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale de cause inconnue généralement définie comme une courbure latérale est supérieure à 10 degrés accompagnés d&#39;une rotation vertébrale 1. La maladie affecte 4% de la population pédiatrique et est le plus souvent diagnostiquée entre l&#39;âge de 9 à 13 ans 2,3,4. Le diagnostic est principalement de l&#39;exclusion et se fait uniquement après avoir écarté les autres causes de déformation de la colonne vertébrale tels que malformation, neuromusculaire ou de troubles syndromiques. Traditionnellement, l&#39;asymétrie trunkal est révélée par Adams essai flexion vers l&#39;avant et mesurée avec scoliomètre lors de l&#39;examen physique 5. Le diagnostic peut être confirmé par observation radiographique de la courbe et de la mesure d&#39;angle selon la méthode de Cobb 6. Une fois diagnostiquée, la principale préoccupation pour les médecins en charge des enfants scoliotiques est de savoir si la courbe va progresser. En effet, la progression de la courbe est souvent imprévisible etest observée chez les filles plus souvent que chez les garçons 7. Si non traitée, la courbe peut progresser de façon spectaculaire, créant une déformation physique importante et même des problèmes cardio-pulmonaires. Ces manifestations deviennent mortelles quand la courbe dépasse 70 ° 8,9. Les options actuelles de traitement pour prévenir ou arrêter la progression de la courbe comprennent contreventement et la chirurgie. En général, contreventement est recommandé pour les courbes entre 25-40 °, tandis que la chirurgie est réservée aux courbes de plus de 45 ° ou qui ne répondent pas à contreventement. Environ 10% des enfants diagnostiqués avec une scoliose idiopathique ont la progression de la courbe nécessitant une intervention chirurgicale corrective 10. Actuellement, il n&#39;existe pas de méthode ou de test disponible pour identifier cette catégorie de patients éprouvée. Par conséquent, tous les enfants diagnostiqués sont soumis à de multiples radiographies sur plusieurs années, habituellement jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la maturité du squelette. On estime que les patients typiques atteints de scoliose devrontenviron 22 examens radiologiques sur une période de 3 ans 11. En raison du risque potentiel de multiples examens radiographiques, les approches alternatives qui pourraient permettre l&#39;exécution du pronostic de la scoliose idiopathique sans exposer les enfants à des rayonnements ionisants sont fortement souhaitable. Avec l&#39;intention de répondre à ce besoin, nous avons déjà mis au point un test de dépistage à base de cellules d&#39;un test pronostique pour identifier tôt les enfants asymptomatiques à risque de développer une scoliose idiopathique. Le test prédit les résultats cliniques chez les enfants asymptomatiques et touchés par l&#39;examen de l&#39;état fonctionnel des protéines Gi et classer les enfants en trois groupes fonctionnels (FG1, FG2 et GR3) selon le degré de réponse maximale à la stimulation de la protéine Gi 12, telle que mesurée par la CDS Système à base d&#39;. Ce système est largement utilisé pour évaluer la transduction des signaux des protéines G par le biais de divers types de cellules 13,14,15,16. Il donne des informations sur laréponse intégrée totale des cellules à des stimuli externes, en mesurant les changements dans l&#39;impédance suite à l&#39;activation des récepteurs de la surface cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans des microplaques contenant des électrodes au fond des puits et le système applique une petite tension qui induisent des courants extracellulaires et transcellulaire. À la suite de l&#39;injection du composé dans le puits, les récepteurs de surface des cellules sont stimulées et des événements de transduction de signal se produisent, ce qui conduit à des changements cellulaires qui affectent la circulation de courants extracellulaires et transcellulaire, et affecter de ce fait la grandeur mesurée. Avec cette approche, les patients et les enfants scoliotiques plus à risque de développer une scoliose sont moins sensibles à la stimulation de la protéine Gi par rapport aux sujets témoins sains, et le classement est basé sur le pourcentage de taux de réduction par rapport au groupe témoin. Les gammes de classification sont fixés entre 10 et 40% pour FG3, 40 et 60% pour FG2, et 60 et 90% pour FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Plus récemment, nous avons modifié cette approche en démontrant que les trois groupes fonctionnels peuvent être clairement distingués en fonction du profil de déséquilibre entre la réponse à Gi et Gs stimulation. En effet, nous avons constaté que la réponse à la stimulation Gi prédominait dans GR3, alors qu&#39;aucun déséquilibre apparent a été observée dans FG2. En revanche, FG1 exposé prédominance de la réponse à la stimulation Gs. En outre, nous avons fourni la preuve que les patients appartenant à FG2 sont plus à risque de progression vers le point d&#39;avoir besoin d&#39;une intervention chirurgicale 17. La précision de ce test de classification a encore été amélioré par la démonstration d&#39;un effet différentiel de l&#39;ostéopontine (OPN) sur la réponse à la stimulation Gi entre les groupes fonctionnels. Ici, nous documentons les étapes détaillées de procédures expérimentales et analytiques de ce test fonctionnel a effectué dans notre laboratoire.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Ce protocole détaille la procédure expérimentale et analytique pour un essai à base de cellules développées dans notre laboratoire comme un test fonctionnel pour prédire le pronostic de la scoliose idiopathique chez les enfants asymptomatiques et affectées. Le test consiste en l&#39;évaluation de l&#39;état fonctionnel de Gi et Gs protéines dans des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) par la spectroscopie diélectrique cellulaire (CDS), en utilisant un instrument à base CDS automatisé, et la classification des enfants en trois groupes fonctionnels (FG1 , GR2, GR3) par rapport au profil du déséquilibre entre le degré de réponse à Gs et Gi protéines stimulation. La classification est en outre confirmée par l&#39;effet différentiel de l&#39;ostéopontine (OPN) sur la réponse à la stimulation Gi entre les groupes et la progression rapide de la maladie est référencé par FG2. Environ, un volume de 10 ml de sang est nécessaire pour extraire des PBMC par gradient de Ficoll-cellules et sont ensuite stockés dans de l&#39;azote liquide. Le nombre adéquat de PBMC pour réaliser le dosage est obtenu après deux jours de culture cellulaire. Essentiellement, les cellules sont d&#39;abord incubées avec phytohemmaglutinin (PHA). Après 24 heures d&#39;incubation, milieu est remplacé par un milieu de culture sans PHA pour une 24 heure supplémentaire avant l&#39;ensemencement des cellules et le traitement OPN. Les cellules sont ensuite examinés par spectroscopie pour leurs réponses à la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol, qui activent respectivement les protéines Gi et Gs par leurs récepteurs apparentés. Tant la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol sont injectés simultanément avec un système fluidique intégré et les réponses des cellules sont surveillés pendant 15 min. Le dosage peut être effectué avec des PBMC fraîches ou congelées et la procédure est terminée en moins de 4 jours.

La viabilité des cellules était comparable entre tous les échantillons avec des valeurs constantes dans la gamme de 86 et 96%. En revanche, de fortes variations ont été observées dans les nombres de cellules dans les échantillons (tableau 3). Sur les 32 échantillons utilisés, deux ont eu un nombre insuffisant de cellules et n&#39;ont pas été classés. Un exemple de résultats de la classification fonctionnelle en fonction du degré de déséquilibre entre Gi et signalisation Gs est montré dans la Figure 3. L&#39;axe vertical de ce chiffre est divisé en trois sections délimitant les groupes fonctionnels avec des gammes dynamiques établies comme&gt; 10 pour GR3, entre +10 et -10 pour FG2, et enfin &lt;-10 pour FG1. Parmi les 30 patients testés ici, 14, 6 et 5 patients ont été clairement classés en GR3, GR2, et FG1, respectivement, tandis que cinq patients, notamment 345, 353, 370, 371, et 382, ​​étaient à la limite de gammes. L&#39;évaluation de l&#39;effet sur la réponse à l&#39;OPN Gi stimulation avait révélé que OPN a augmenté la réponse en papatients 353 et 371. En revanche, la réaction a été réduit de plus de 50% chez les patients 345 et 382 et par moins de 50% chez le patient après un traitement rOPN 370. Ainsi, selon nos critères de classification (tableau 2), nous avons été en mesure de classer les patients 353 et 371 dans FG1, patients et 345 382 dans FG2, et le patient 370 dans GR3. En parallèle, tous les patients ont été évalués pour leur réponse à la stimulation de la protéine Gi et comparés à des sujets témoins. Comme prévu, tous les patients étaient moins sensibles que les sujets témoins et des patients classés dans le même groupe fonctionnel par notre nouveau procédé montré des niveaux similaires de la réponse maximale (Figure 5). En outre, les disparités entre les patients de chaque groupe fonctionnel est compatible avec notre gamme classique de classification 12, validant notre nouvelle procédure. La classification d&#39;une grande cohorte de patients scoliotiques régulièrement suivis dans notre clinique spécialisée à l&#39;Hôpital Sainte-Justine a révélé que les troisdes groupes fonctionnels ont été distribués de manière similaire chez les cas modérés, tandis que le FG2 était prédominante chez les cas graves (figure 6), l&#39;identification des patients classés dans ce groupe fonctionnel comme plus à risque de progression rapide de la maladie et qui indique que ce test de classification peut être utile dans l&#39; pronostic de la scoliose idiopathique. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Solution A </td><td> D-glucose anhydre </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Solution B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solution saline équilibrée (BSS) </td><td> Solution A </td><td> 1 volume </td></tr><tr><td> Solution B </td><td> 9 volumes </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; médias complet </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Médias supplémentaires </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Milieu de congélation </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> médias de PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycosique </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohémaglutinine </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Essentialsolutions. <table border="1"><tbody><tr><td> Plages dynamiques avec Ag </td><td> Groupes fonctionnels </td><td> Plages dynamiques avec Fe </td></tr><tr><td> Ag &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;Ag &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> Ag&gt; 10 </td><td> GR3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Catégorisation des groupes fonctionnels selon les gammes dynamiques établis avec Ag et Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Patients </td><td> Viabilité (%) </td><td> La concentration cellulaire (× 10 6 / ml) </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11,64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90,5</td><td> 13,6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Nombre insuffisant de cellules </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8,92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95,1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92,3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2.2 </td><td> Nombre insuffisant de cellules </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10,9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88,8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93,1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14,82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89,1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Pour cent viabilité et concentration cellulaire telle que déterminée en utilisant un compteur de cellules automatique et la viabilité analyseur. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figure 1. Conception pour l&#39;ensemencement des cellules. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figure 2.Concevez pour la distribution des composés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figure 3. La gamme dynamique de la classification fonctionnelle en utilisant le système basé sur le CDS. Le graphique illustre les valeurs du degré de déséquilibre entre les réponses à Gs et Gi stimulation obtenue dans les PBMC provenant de patients atteints de scoliose idiopathique. Les valeurs ont été mesurées par le système basé sur le CDS en réponse à 10 uM de la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol. Chaque point représente la Ag des deux réponses en double. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figure 4. Effet de rOPN sur la réponse à la stimulation Gi dans les CMSP. Les cellules ont été privées de sérum pendant 18 heures en présence ou en absence de 0,5 pg / ml rOPN et ensuite stimulées avec 10<html> 56; M de la somatostatine pour initier la réponse cellulaire Gi-médiation. Les données dans le graphique ont été générées à partir de l&#39;impédance maximum-minimum et correspondent à la moyenne de la réponse en double exemplaire. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figure 5. D&#39;état fonctionnel de la protéine Gi dans les CMSP de contrôle et les sujets scoliostic. PBMC de sujets témoins et des patients scoliotiques ont été exposés à des concentrations croissantes de la somatostatine pour stimuler protéines Gi via récepteur de la somatostatine endogène. La réponse cellulaire a été mesurée par un système à base de CDS de la manière décrite dans la section de la procédure. Courbes ont été générées à partir d&#39;impédance maximale et minimale. Chaque courbe représente la régression non linéaire. Les données ont été normalisées à la réponse maximale dans des cellules provenant de sujets de contrôle et chaque point correspond à la moyenne de la réponse en double exemplaire./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figure 6. Répartition des groupes fonctionnels entre les différentes phases de la scoliose. Une grande cohorte de patients scoliotiques 794 modérés (entre 10-44 ° courbures) et 162 cas graves (courbure supérieur à 45 °) régulièrement suivis à l&#39;Hôpital Sainte-Justine, ont été classés en fonction de leur degré de déséquilibre entre la réponse à Gi et Gs stimulation. Réponses ont été mesurées par le système basé sur le CDS en réponse à 10 uM de la somatostatine et de l&#39;isoprotérénol.

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Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Un protocole structuré est présentée pour un dosage à base de cellules comme un test fonctionnel pour prédire le pronostic de la scoliose idiopathique de l&#39;utilisation de la spectroscopie diélectrique cellulaire (CDS). Le dosage peut être effectué avec des cellules mononucléaires de sang périphérique fraîches ou congelées (PBMC) et la procédure est terminée en moins de 4 jours.

Protocole de dosage à base de cellules pour la prédiction du pronostic de la scoliose idiopathique de l&#39;aide Cellular Spectroscopie Diélectrique

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

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