Name: cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, Frankrike (til Dr. Moreau), The Canadian Institutes of Health Research (gi PP2-99466 til Dr. Moreau) og fra Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (Research tilskudd til Dr. Moreau).

Hele fremgangsmåten blir utført under sterile biologisk hetten og alle løsninger og utstyr for å komme i kontakt med cellene, må være sterile. En. Utarbeidelse av Essential Solutions <ol><li> Forbered løsninger i henhold til tabell 1. </li><li> Hold balanserte saltoppløsning (BSS) ved romtemperatur, og alle andre løsninger ved 4 ° C til tidspunktet for bruk. </li><li> Varm kaldt media til 37 ° C i vannbad i noen minutter før du bruker. </li></ol> 2. Utarbeidelse og oppbevaring av PBMC <ol><li> Samle 10 ml fullblod i EDTA-behandlede prøverør for å tilberede to porsjoner av PBMC under anvendelse av 5 ml for hver prøve. </li><li> Overføring 5 ml fullblod fra EDTA-behandlet samling rør til et 50 ml rør. </li><li> Til et likt volum av BSS og bland prøven ved forsiktig pipettering opp og ned. </li><li> Plasser 3 ml Ficoll i to 15 ml Falcon-rør. </li><li> Nøye lag 4,5 mlav fortynnet blodblandingen over Ficoll i hvert rør. </li><li> La rørene hviler i opp til 5 minutter for å favorisere en klar adskillelse av blod og Ficoll. </li><li> Sentrifuger rør ved 400 xg i 30 min ved romtemperatur uten bremser. </li><li> Fjern forsiktig rørene fra sentrifugen, slik som å ikke forstyrre lagdeling. De PBMC er synlige på BSS / Ficoll grensesnitt. </li><li> Høste skyet lag av PBMCs i grenselandet mellom begge rørene med en pipette og overføre til en ny 50 ml tube. </li><li> Tilsett 20 ml komplett medium. </li><li> Sentrifuger røret ved 288 x g i 7 min ved romtemperatur. </li><li> Supernatanten fjernes ved aspirasjon. </li><li> Resuspender cellepelleten i 500 ul av tilleggsmateriale. </li><li> Til et likt volum av frysemediet. </li><li> Overfør cellesuspensjonen til en cryovial. </li><li> Plasser cryovial inn en cryofreezing container med isopropanol. </li><li> Oppbevar innfrysningskar ved -80 ° C over natten. </li><li> Transfer de frosne PBMC delmengde til flytende nitrogen for langtidslagring. </li></ol> Tre. Funksjonell analyse En. Dag 1 <ol><li> Plasser aliquot av flytende nitrogen i vannbad ved 37 ° C i ett minutt eller inntil tint. </li><li> Overfør cellesuspensjonen til en 50 ml rør med en steril pipette. </li><li> Tilsett 15 ml av komplette medier og spinne cellene ned ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur. </li><li> Supernatanten fjernes ved aspirasjon. </li><li> Forsiktig suspen cellepelleten i 1 ml PHA media. </li><li> Fullfør volumet til 20 ml med de samme mediene. </li><li> Sett lokk på røret løst å slippe inn luft. </li><li> La røret over natten ved 37 ° C i en CO 2 inkubator å tillate hvilende lymfocytter å forvandle seg raskt-prolifererende lymphoblasts. </li></ol> 2. Dag 2 <ol><li> Ta slangen ut av inkubatoren, skru caps helt og spinne cellene ned ved 200 xg i 5 minved romtemperatur. </li><li> Supernatanten fjernes ved aspirasjon. </li><li> Forsiktig suspendere cellepelleten i 1 ml av komplette media. </li><li> Fullfør volumet til 20 ml med de samme mediene. </li><li> Sett lokk på røret løst å slippe inn luft. </li><li> La røret over natten ved 37 ° C i en CO2-inkubator for å utvide celletall. </li></ol> Tre. Dag 3 <ol><li> Få røret ut av inkubatoren, skru caps helt og spinne cellene ned ved 200 xg i 5 min ved romtemperatur. </li><li> Supernatanten fjernes ved aspirasjon. </li><li> Vask cellene to ganger med 10 ml RPMI-1640 ved sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur. </li><li> Forsiktig cellepelleten suspenderes i 600 ul av RPMI-1640. </li><li> Mål cellekonsentrasjon og levedyktighet, ved hjelp av en automatisk celleteller og levedyktighet analysator. </li><li> Legg passende volum av RPMI-1640 for å justere til en cellekonsentrasjon på 1,5 x 10 5 mL cells/20. </li&gt; <li> Unn-celler med rekombinant OPN (rOPN) eller bærer (PBS) i 1,5 ml Eppendorf-rør. <ol><li> Overfør 100 ul cellesuspensjon til to sterile 1,5 ml Eppendorf-rør. </li><li> Legg rOPN i ett rør til en sluttkonsentrasjon på 0,5 pg / ml. </li><li> Til et like stort volum PBS i det andre røret. </li><li> Bland forsiktig hver tilstand ved pipettering opp og ned to ganger ved hjelp av en steril pipette sett på 100 mL. </li></ol></li><li> Klargjør lite utvalg 96-brønns mikro. <ol><li> Tilsett 5 ul av RPMI-1640 til hver brønn. </li><li> Sentrifuger plate ved 200 x g i 3 minutter for å fjerne alle luftbobler. </li></ol></li><li> Seed de ubehandlede celler og celler behandlet med rOPN eller PBS. <ol><li> Før overføring av celler fra rør til mikroplate, forsiktig pipettere opp og ned en gang for å sikre en jevn suspensjon av celler. </li><li> Til 40 ul av cellesuspensjon per brønn i fire eksemplarer til ubehandlede celler, i duplikat for rOPN eller PBS behandlede celler. Refer til Figur 1 for design. Denne designen gjør at 12 pasienter til å bli testet på den samme mikro. </li><li> La celleplaten under sterile hetten i 5 min for å tillate cellene å hvile og slå seg jevnt på bunnen av brønnen før de legges i inkubatoren. </li></ol></li><li> Inkuber platen i 18 timer ved 37 ° C i en CO2-inkubator for å optimalisere effekten av OPN. </li></ol> 4. Dag 4 <ol><li> Kjør plate med forbindelser. <ol><li> Ta platen ut av kuvøse og la den på RT for rundt 30 min. </li><li> Forbered 1 ml av 100 uM av somatostatin og isoproterenol i RPMI-1640 ved tilsetning av 10 ul av stamløsningen (10 mM) i 990 ul av RPMI-1640. </li><li> Fyll det sammensatte plate ved dispensering av 20 ul i passende brønner, som angitt i figur 2.. </li><li> Dekker forbindelsen plate med en perforerbar, oppkuttet tetning for å unngå forandring i konsentrasjon av forbindelsen på grunn av fordampning føreller i løpet av inkubasjon i CDS-systemet. </li><li> Last celle plate, pipetter, og sammensatte plate inn i CDS-basert system. </li><li> Navn platen i CDS-baserte instrument programvare. </li><li> Velg den aktuelle protokollen. Protokollen redigert for klassifisering med PBMCs kalles &#39;Agonist Non-heftende celler lite utvalg Plate RT 15 min&#39;. Gå til protokollen boksen og velg denne protokollen i listen over protokoller </li><li> Initiere protokollen ved å klikke på &quot;Start&quot;. </li><li> Den integrerte lufthåndtering system tilfører samtidig forbindelsene til alle brønner ved å injisere 5 pl per brønn for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 uM i et totalt volum på 50 pl. </li><li> Den CDS-systemet samler automatisk dataene i 15 minutter etter at forbindelsen tilsetningen. </li></ol></li><li> Dataanalyse <ol><li> Velg lave og høye nivåer av frekvenser til bruk ved beregning hentet verdier for nonadherente celler. </li><li> Velg drift korreksjon for å korrigere den lineære endring i utgangs impedans-målinger over tid. </li><li> Velg data filtrering for å redusere variasjoner i den kinetiske responsen måling skyldes elektronisk støy og sammensatte tillegg. </li><li> Velg Max-Min metode for hele analysetiden. </li><li> Eksportere data til Excel under alternativet plate format. </li><li> Beregn delta G (ΔG) ved å trekke den gjennomsnittlige respons magnitude å Gi stimulering (RmGi) fra gjennomsnittet av respons magnitude til Gs stimulering (RmGs) ved hjelp av følgende formel: ΔG = RmGi - RmGs </li><li> Beregn prosentandelen av fold effekt (Fe) av OPN på Gi-mediert reaksjon ved å dele den gjennomsnittlige respons magnitude til Gi stimulering i nærvær av OPN (RmGiOPN) med den gjennomsnittlige respons magnitude å GI stimulering i nærvær av PBS ( RmGiPBS) med følgende formel: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Referer til Tstand to å klassifisere pasientene. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence:+a+call+for+a+statement+of+terms.">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li><li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+screening+for+scoliosis.">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li><li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+idiopathic+scoliosis:+natural+history+and+long+term+treatment+effects.">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).</li><li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening.">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li><li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+screening+for+scoliosis:+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer?.">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?.</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoliosis+imaging:+what+radiologists+should+know.">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li><li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren:+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program.">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li><li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis.">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li><li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+scoliosis.">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li><li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li><li>Nash, C. L., Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis.">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Dette arbeidet førte til flere patenter hold av Sainte-Justine universitetssykehus og mange andre venter i flere land. Fjerde Dimension Spine LLC er eksklusiv rettighetshaver av Sainte-Justine universitetssykehus.

Vi har beskrevet en detaljert fremgangsmåte av en cellebasert prognostisk test for idiopatisk skoliose som gjelder for perifere mononukleære blodceller (PBMC) fersk isolert eller konservert frosset i opptil ett år i flytende nitrogen. Siden du bruker nylig isolerte PBMC er tungvint når testing stort antall individer, ble prosedyren presenteres med frosne PBMC som tilbyr en mer praktisk alternativ i klinisk setting. Men problemer med celle klumper ved tining ble påtruffet da frosne PBMC ble opprinnelig brukt, fører noen ganger til inter-assay variasjon. For å maksimere analysen reproduserbarhet, anbefaler vi unngår fryse-tine syklus og bruker den frosne prøven bare én gang. Fremgangsmåten er meget enkel, slik at for nøyaktig deteksjon av defekte Gi protein funksjon i løpet av kort tid. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, kan asymptomatiske og scoliotic barn lett bli klassifisert til å bedre forutsi deres kliniske utfall uten noen fare for deres helse. HoWever, når du utfører klassifisering i henhold til graden av maksimal respons på Gi stimulering i forhold til de friske kontrollpersoner 12, flere krav til kontrollpersoner bør være oppfylt. Faktisk, for å få en riktig sammenligning årsklasse, må kontrollpersoner være alder og kjønn matchet, ikke være på noen form for medisiner, og gi private opplysninger som tidligere individuelle / familiær sykehistorie. Disse kravene kan utgjøre et viktig hinder for rekruttering av kontrollpersoner. Derfor utfører klassifisering ved å undersøke graden av ubalanse mellom respons på Gi og Gs protein stimulering i samme individ er ideell for å eliminere nødvendigheten av å bruke kontrollpersoner. Bruken av CDS-systemet til å utføre denne prognostisk test er betydelig i forhold til samtidig å gi Gi-og Gs-medierte cellulære responser i samme assay. Selv om mange pasienter kan klassifiseres uten ambiguity ved hjelp av det dynamiske området fast for denne analysen, vil et lite antall pasienter viser verdier ved grensen mot områder, som illustrert ved resultatene av den foreliggende rapport. Å diskriminere disse personene, har vi innført en evaluering av effekten av OPN på respons på Gi stimulering ved å demonstrere at OPN induserer en differensiell effekt på Gi-mediert cellulær respons blant de tre funksjonelle grupper. Ja, vi fant at i nærvær av OPN, respons på Gi stimulering økninger i FG1, mens det avtar i FG2 og FG3, til en høyere grad i FG2. Til tross for den høye kostnaden for OPN, er bruken av denne chemokine viktig å skille tvetydige tilfeller, og derfor forbedre nøyaktigheten av vår klassifiseringsanalyse. Imidlertid har denne analysen en ulempe i at et minimum på 1,5 x 10 5 celler per brønn er nødvendig for å observere cellulær respons med CDS-systemet i henhold til våre forsøksbetingelser. Prøvene visse pasient vil ikke ha et tilstrekkelig antallceller som skal testes. I dette tilfellet er det nødvendig å minne pasientene for ytterligere blodprøvetaking, noe som kan være bekymringsfullt for familier og frustrerende for medisinsk og laboratoriepersonalet. Prospektive studier er planlagt i vårt laboratorium for å løse dette problemet. Ikke desto mindre, avhengig av gjeldende protokollen på enkle og velprøvde fremgangsmåter for å tilberede celler, mens testingen er automatisert ved bruk av et validert etikett-fritt system 13, 14 for å overvåke cellenes respons. Testingen plattformen er relativt billig sammenlignet med genetisk plattformen tilgjengelig for prognose av andre sykdommer. Også kostnadene for alle de engangsmateriell, inkludert blod samling rør, tips, den spesielle elektrode mikroplater, og konisk og Eppendorf-rør, er ikke veldig dyrt og er anslått til mindre enn $ 3000 for å fullføre en test for ca ett tusen pasienter. Selv om dette anslag ikke omfatter arbeidskostnader for fremstilling av prøverog utføre testen, forblir denne testen betydelig rimeligere enn neste generasjons sekvense plattformer. Verdt å merke seg, er ikke bare kostnadene sammenlignet genetiske plattformer, men mer spesifikt knyttet til feltet av AIS, er kostnadene knyttet til radiologisk bildebehandling. I dag er mer enn én million barn i USA og om lag 100.000 barn i Canada diagnostisert med idiopatisk skoliose, og den totale kostnaden for diagnostisering og monitorering av de scoliotic barn av X-ray eksponering er over 2,5 milliarder dollar årlig i Nord-Amerika. Dermed vil våre cellebasert assay fremgangsmåte forventes å være egnet for rutinemessig screening og overvåking av barn med idiopatisk skoliose uten helserisiko og til en lavere kostnad.

Idiopatisk skoliose er en ryggrad misdannelse av ukjent årsak generelt definert som en lateral krumning høyere enn 10 grader ledsaget av en ryggvirvel rotasjon en. Tilstanden rammer 4% av barnepopulasjonen, og er oftest diagnostisert i alderen 9 til 13 år 2,3,4. Diagnosen er hovedsakelig av utelukkelse og er laget kun etter utelukker andre årsaker til spinal misdannelse som ryggvirvel misdannelse, nevromuskulær eller syndromsykdommer. Tradisjonelt er det trunkal asymmetri avslørt av Adams frem bøying test og målt med scoliometer under fysisk undersøkelse fem. Diagnosen kan deretter bekreftes ved røntgen observasjon av kurven og vinkelmålingen ved hjelp av Cobb-metoden 6.. Når diagnosen, er den primære bekymring for leger i å håndtere scoliotic barn om kurven vil fremgang. Faktisk, er den kurve progresjon ofte uforutsigbare oger oftere observert blant jenter enn hos gutter 7. Hvis ubehandlet, kan kurven fremgang dramatisk, skaper betydelig fysisk deformitet og selv kardiopulmonære problemer. Disse manifestasjonene bli livstruende når kurven overstiger 70 ° 8,9. Den nåværende behandlingsalternativer for å hindre eller stanse kurve progresjon inkluderer oppkvikkende og kirurgi. Generelt er oppkvikkende anbefales for kurver mellom 25-40 °, mens kirurgi er reservert for kurver større enn 45 ° eller ikke svarer til avstiving. Omtrent 10% av barn diagnostisert med idiopatisk skoliose har kurve progresjon krever korrigerende kirurgi 10. Det finnes for tiden ingen god metode eller test tilgjengelig for å identifisere denne kategori av pasienter. Følgelig er alle diagnostiserte barn utsatt for flere røntgenbilder over flere år, som regel før de når skjelett modenhet. Det er anslått at de typiske pasienter med skoliose fårca 22 radiologiske undersøkelser i løpet av en tre-års periode 11. På grunn av den potensielle risikoen for flere radiografiske undersøkelser, de alternative tilnærminger som kan tillate å utføre prognosen av idiopatisk skoliose uten å utsette barn for ioniserende stråling er sterkt ønskelig. Med den hensikt å møte dette behovet, har vi tidligere utviklet en cellebasert screening-analysen som en prognostisk test for å raskere identifisere de asymptomatiske barn med risiko for å utvikle idiopatisk skoliose. Testen spår den kliniske utfall i begge asymptomatiske og berørte barn ved å undersøke den funksjonelle statusen Gi proteiner og klassifisere barn inn i tre funksjonelle grupper (FG1, FG2 og FG3) i henhold til graden av maksimal respons på Gi protein stimulering 12 målt ved CDS basert system. Dette systemet er i stor grad brukt til å vurdere signaltransduksjon gjennom G proteiner i ulike celletyper 13,14,15,16. Det gir informasjon vedrørendetotal integrert respons av cellene til de ytre stimuli ved å måle endringer i impedansen som følge av aktivering av celleoverflatereseptorer. Celler blir utsådd i mikroplater som inneholder elektrodene på bunnen av brønnene og systemet anvender en liten spenning som induserer ekstracellulære og transcellular strømninger. Følgende forbindelse injeksjon i brønnen, er celleoverflate-reseptorer stimuleres og signaltransduksjon hendelser inntreffer, noe som fører til cellulære endringer som påvirker strømmen av ekstracellulære og transcellular strømmer, og derved påvirke den målte størrelse. Med denne tilnærmingen, scoliotic pasienter og barn mer utsatt for å utvikle skoliose er mindre mottakelig for Gi protein stimulering sammenlignet med friske kontrollpersoner, og klassifiseringen er basert på prosentandelen av grad av reduksjon i forhold til kontrollgruppen. De klassifiseringskjeder er festet mellom 10 og 40% for FG3, 40 og 60% for FG2, og 60 og 90% for FG1 12.. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Mer nylig har vi endret denne tilnærmingen ved å vise at de tre funksjonelle grupper kan tydelig skilles i henhold til profilen til ubalanse mellom respons på Gi og Gs stimulering. Ja, vi fant at respons på Gi stimulering dominerte i FG3, mens noen åpenbar ubalanse ble observert i FG2. I motsetning til dette oppviste FG1 overvekt for respons til Gs stimulering. I tillegg har vi gitt bevis for at pasienter som tilhører FG2 er mer utsatt for å utvikle til poenget med behov for kirurgi 17. Presisjonen av denne klassifiseringen testen har ytterligere blitt forbedret ved å demonstrere en differensial effekten av osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blant funksjonelle grupper. Her vi dokumentere detaljert fremgangsmåte av eksperimentelle og analytiske prosedyrer av denne funksjonstesten som i dag utføres i vårt laboratorium.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Denne protokollen beskriver eksperimentelle og analytiske prosedyre for et cellebasert assay utviklet i vårt laboratorium som en funksjonell test for å forutsi prognose av idiopatisk skoliose hos asymptomatiske og berørte barn. Analysen består av evalueringen av funksjonell status for GI og Gs proteiner i perifert blod mononukleære celler (PBMC) av cellulær dielektrisk spektroskopi (CDS), ved hjelp av en automatisert CDS-basert instrument, og klassifiseringen av barna i tre funksjonelle grupper (FG1 , FG2, FG3) med hensyn til beskrivelsen av ubalanse mellom graden av respons til Gi-og Gs proteiner stimulering. Klassifiseringen er ytterligere bekreftet av differensial effekten av osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blant grupper og alvorlig progresjon av sykdommen er referert av FG2. Omtrent, blir et volum på 10 ml blod er nødvendig for å trekke ut PBMC ved Ficoll-gradient, og cellene blir deretter lagret i flytende nitrogen. Den tilstrekkelig antall PBMCs å utføre analysen oppnås etter to dager etter cellekultur. I hovedsak er celler første inkuberes med phytohemmaglutinin (PHA). Etter 24 timers inkubasjon blir mediet erstattet med et PHA fritt kulturmedium i ytterligere 24 timer før celle såing og OPN behandling. Cellene blir deretter spectroscopically screenet for deres svar på somatostatin og isoproterenol, som henholdsvis aktivere GI og Gs proteiner gjennom sine beslektede reseptorer. Både somatostatin og isoproterenol blir samtidig injisert med en integrert lufthåndtering system og cellenes respons blir overvåket i 15 min. Analysen kan utføres med friske eller frosne PBMC og prosedyren er fullført innen fire dager.

Cell levedyktighet var sammenlignbar i alle prøver med verdier gjennomført i området fra 86 og 96%. I motsetning til dette ble det høye variasjoner er angitt i celle tall mellom prøvene (tabell 3). Av de 32 prøvene som brukes, to hadde tilstrekkelig antall celler og har ikke blitt klassifisert. Et eksempel på resultatene av den funksjonelle klassifisering i henhold til graden av ubalanse mellom Gi og Gs signalisering er vist i figur 3.. Den vertikale aksen i dette tallet er delt inn i tre seksjoner opptegning av funksjonelle grupper med dynamiske områder etablert som&gt; 10 for FG3, mellom 10 og -10 for FG2, og til slutt &lt;-10 for FG1. Blant 30 pasienter som ble testet her, ble 14 og 6, og 5 pasienter tydelig klassifisert i FG3, FG2 og FG1 henholdsvis, mens fem pasienter, spesielt 345, 353, 370, 371 og 382, ​​var på grensen av områder. Evalueringen av OPN effekt på respons på Gi stimulering hadde avslørt at OPN økt responstid i patients 353 og 371. I motsetning til dette ble respons reduseres med mer enn 50% hos pasienter 345 og 382, ​​og ved mindre enn 50% i pasienten 370 etter rOPN behandling. Så, i henhold til våre klassifiseringskriteriene (Tabell 2), var vi i stand til å kategorisere pasienter 353 og 371 i FG1, pasienter 345 og 382 i FG2, og pasienten 370 i FG3. Parallelt med dette ble alle pasienter screenet for sin respons overfor Gi protein stimulering og sammenlignet med kontrollpersoner. Som forventet, alle pasienter var mindre følsom enn kontrollpersoner, og pasienter klassifisert i den samme funksjonelle gruppe ved den nye fremgangsmåte oppviste tilsvarende nivåer av den maksimale respons (figur 5). Videre misforhold mellom pasienter av hver funksjonell gruppe var konsistent med vår klassiske utvalg av klassifisering 12, validere vår nye prosedyren. Klassifiseringen av en stor kohort av scoliotic pasienter jevnlig fulgt i vår spesialklinikk på Sainte-Justine Hospital har avdekket at de trefunksjonelle grupper var tilsvarende fordelt mellom moderate tilfeller, mens FG2 var dominerende blant alvorlige tilfeller (figur 6), å identifisere pasienter kategorisert i denne funksjonelle gruppe som er mer utsatt for alvorlige utviklingen av sykdommen, og som indikerer at denne klassifisering test kan være nyttig i prognose av idiopatisk skoliose. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Løsning A </td><td> Vannfri D-glucose </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 0,05 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Løsning B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Balanced Salt Solution (BSS) </td><td> Løsning A </td><td> 1 volum </td></tr><tr><td> Løsning B </td><td> 9 volum </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; Komplett media </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Supplerende medier </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Frysing media </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHA media </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimycotic </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohemaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Essentialløsninger. <table border="1"><tbody><tr><td> Dynamiske områder med ΔG </td><td> Funksjonelle grupper </td><td> Dynamiske områder med Fe </td></tr><tr><td> ΔG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> ΔG&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Kategorisering av funksjonelle grupper i henhold til dynamiske områder etablert med ΔG og Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Pasienter </td><td> Livskraftig (%) </td><td> Cell konsentrasjon (x 10 6 / ml) </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> For lite antall celler </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8,28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7,51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7,67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7,84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> For lite antall celler </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9,99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8,46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7,73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Prosent levedyktighet og cellekonsentrasjonen som er bestemt ved hjelp av en automatisk celleteller og levedyktighet analysator. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figur 1. Design for celle seeding. <img alt="Fig. 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figur 2.Design for utlevering forbindelser. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figur 3. Dynamisk omfang av den funksjonelle klassifisering ved hjelp av CDS-basert system. Grafen viser verdier av graden av ubalanse mellom svarene på Gi og Gs stimulering oppnådd i PBMCs fra pasienter med idiopatisk skoliose. Verdier ble målt ved CDS-systemet som reaksjon på 10 uM av somatostatin og isoproterenol. Hvert punkt representerer ΔG av begge responser i duplikat. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figur 4 Effekt av rOPN på respons på Gi stimulering i PBMCs.. Celler ble serum-sultet i 18 timer i nærvær eller fravær av 0,5 mikrogram / ml rOPN og deretter stimulert med 10<html> 56, M av somatostatin å initiere Gi-mediert cellulær respons. Data i grafen ble samlet maksimal-minimum-impedans og svarer til gjennomsnittet av responsen i duplikat. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figur 5. Funksjonell status Gi protein i PBMCs fra kontroll og scoliostic fag. PBMCs fra kontrollpersoner og scoliotic pasienter ble utsatt for økende konsentrasjoner av somatostatin å stimulere Gi proteiner via endogen somatostatin reseptorer. Den cellulære respons ble målt ved CDS-systemet, som beskrevet i fremgangsmåten delen. Curves ble samlet maksimal-minimum impedans. Hver kurve representerer det ikke-lineær regresjon. Data ble normalisert til maksimal respons i celler fra kontrollpersoner, og hvert punkt svarer til gjennomsnittet av responsen i duplikat./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større figur. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figur 6. Fordeling av funksjonelle grupper blant ulike faser av skoliose. En stor kohort av scoliotic pasienter med 794 moderat (kurvaturer mellom 10-44 °) og 162 alvorlige (kurvatur større enn 45 °) tilfeller jevnlig følges på Sainte-Justine Hospital, ble klassifisert i henhold til deres grad av ubalanse mellom respons på Gi og Gs stimulering. Responser ble målt ved CDS-systemet som reaksjon på 10 uM av somatostatin og isoproterenol.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

En strukturert protokoll er presentert for et cellebasert assay som en funksjonell test for å forutsi prognosen av idiopatisk skoliose ved hjelp av mobilnettet dielektrisk spektroskopi (CDS). Analysen kan bli utført med friske eller frosne perifere mononukleære blodceller (PBMC), og fremgangsmåten er fullført i løpet av 4 dager.

Cell-baserte analyseprotokollen for den prognostiske Prediksjon av idiopatisk skoliose Bruke Cellular Dielektrisk spektroskopi

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Collection Protocol for Human Pancreas

Innsamling Protokoll for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Fokus Dannelse: En Cell-basert analyse for å bestemme onkogent potensiale av en Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffuse optisk spektroskopi for kvantitativ vurdering av akutt Ioniserende stråling Induced Skin Toxicity bruke en mus modell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em&gt; I Vivo</em&gt; Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Identifisere hemmere av HBx-DDB1 interaksjon ved hjelp av en Split luciferase analysen system

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Kvantifisering av synsnervens tverrsnittsområde på MR: En ny protokoll ved hjelp av Fiji-programvare

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...