Name: cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от La Fondation Ив Cotrel де l&#39;Institut де Франс, Париж, Франция (до доктора Моро), Канадские Институты Исследования Здоровья (грант РР2-99466, чтобы доктора Моро) и от четвертого измерения позвоночника ООО , Нью-Йорк, США (Грант для доктора Моро).

Вся процедура проводится под стерильной биологической капотом и все решения и оборудование вступления в контакт с клетками, должны быть стерильными. 1. Подготовка основных решений <ol><li> Подготовка растворов в соответствии с таблицей 1. </li><li> Хранить сбалансированный солевой раствор (BSS) при комнатной температуре и всех других растворов при 4 ° С до момента использования. </li><li> Теплый холодной СМИ до 37 ° С в водяной бане в течение нескольких минут, прежде чем использовать. </li></ol> 2. Подготовка и хранение МНПК <ol><li> Сбор 10 мл цельной крови в ЭДТА, обработанных сбора труб подготовить две аликвоты РВМС с помощью 5 мл для каждой аликвоты. </li><li> Передача 5 мл цельной крови из обработанной ЭДТА пробирку на 50 мл пробирку. </li><li> Добавить равный объем BSS и смешать образец, осторожно пипеткой вверх и вниз. </li><li> Поместите 3 мл Ficoll в двух 15 мл пробирки Фалкон. </li><li> Осторожно слой 4,5 млиз разбавляют смесь крови на фиколла в каждой пробирке. </li><li> Пусть трубы отдохнуть на срок до 5 мин в пользу четкое разделение крови и фиколла. </li><li> Центрифугируйте пробирки при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре, без тормоза. </li><li> Осторожно удалить трубки из центрифуги так, чтобы не нарушить слоев. РВМС могут видеть на границе BSS / Ficoll. </li><li> Урожай мутный слой РВМС на стыке двух труб с помощью пипетки и переход к новой 50 мл пробирку. </li><li> Добавить 20 мл полной среды. </li><li> Центрифуга трубки при 288 х г в течение 7 мин при комнатной температуре. </li><li> Удалить супернатант аспирацией. </li><li> Ресуспендируют клеточный осадок в 500 мкл дополнительных средств массовой информации. </li><li> Добавить равный объем морозильных СМИ. </li><li> Передача клеточной суспензии в криопробирку. </li><li> Поместите криопробирку в cryofreezing контейнер с изопропанола. </li><li> Хранить контейнер замораживание при -80 ° С в течение ночи. </li><li> Трansfer замороженные МНПК кратны жидком азоте в течение длительного хранения. </li></ol> 3. Функциональный анализ 1. День 1 <ol><li> Поместите аликвоты из жидкого азота в водяной бане при 37 ° С в течение минуты или до размораживания. </li><li> Передача клеточной суспензии в 50 мл пробирку с стерильной пипетки. </li><li> Добавьте 15 мл полной среды и спин клетки вниз при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Удалить супернатант аспирацией. </li><li> Аккуратно приостановить осадок клеток в 1 мл PHA СМИ. </li><li> Заполните объем до 20 мл с той же информации. </li><li> Закройте пробирку крышкой свободно, чтобы воздух мог войти. </li><li> Оставьте трубку в течение ночи при 37 ° С в СО 2-инкубатор, чтобы покоящиеся лимфоциты превратить в быстро-пролиферирующих лимфобластах. </li></ol> 2. День 2 <ol><li> Возьми трубку из инкубатора, винтовые колпачки полностью и спин клетки вниз на 200 мкг в течение 5 минпри комнатной температуре. </li><li> Удалить супернатант аспирацией. </li><li> Осторожно приостановить осадок клеток в 1 мл полной среды. </li><li> Заполните объем до 20 мл с той же информации. </li><li> Закройте пробирку крышкой свободно, чтобы воздух мог войти. </li><li> Оставьте трубку в течение ночи при 37 ° С в СО 2-инкубаторе расширить число клеток. </li></ol> 3. День 3 <ol><li> Получить трубку из инкубатора, винтовые крышки полностью и спин клетки вниз при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Удалить супернатант аспирацией. </li><li> Промыть клетки дважды с 10 мл RPMI-1640 центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Осторожно ресуспендируют осадок клеток в 600 мкл RPMI-1640. </li><li> Измерить концентрацию клеток и жизнеспособность, с использованием автоматического счетчика клеток и жизнеспособность анализатора. </li><li> Добавить соответствующий объем RPMI-1640, чтобы приспособиться к концентрации клеток 1,5 × 10 5 cells/20 мкл. </lя&gt; <li> Treat клетки рекомбинантного OPN (rOPN) или носитель (PBS) в 1,5 мл пробирки Эппендорфа. <ol><li> Передача 100 мкл клеточной суспензии на две стерильные 1,5 мл пробирки Эппендорфа. </li><li> Добавить rOPN в одной пробирке до конечной концентрации 0,5 мкг / мл. </li><li> Добавить равный объем PBS во втором трубки. </li><li> Аккуратно перемешайте каждое условие с помощью пипетки вверх и вниз в два раза с помощью стерильного набора пипетки на 100 мкл. </li></ol></li><li> Подготовьте небольшой образец 96-а планшет. <ol><li> Добавьте 5 мкл RPMI-1640 в каждую лунку. </li><li> Центрифуга пластины при 200 х г в течение 3 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха. </li></ol></li><li> Seed необработанные клетки, а также клетки, обработанные rOPN или PBS. <ol><li> Перед передачей клетки от трубки, чтобы микропланшет, осторожно пипеткой вверх и вниз один раз, чтобы гарантировать однородную суспензию клеток. </li><li> Добавить 40 мкл клеточной суспензии на лунку в четырех для необработанных клеток, в двух экземплярах для rOPN или PBS обработали клетки. Рефер, на рисунке 1 конструкции. Такая конструкция позволяет 12 пациентов пройти тест на том же микропланшет. </li><li> Оставьте клеток пластину под стерильных капот в течение 5 мин, чтобы позволить клеткам отдохнуть и поселиться равномерно на дно колодца до размещения в инкубаторе. </li></ol></li><li> Инкубировать в течение 18 часов при 37 ° С в СО 2-инкубаторе, чтобы оптимизировать эффект OPN. </li></ol> 4. День 4 <ol><li> Запуск пластины с соединения. <ol><li> Возьмите тарелку из инкубатора и оставить его при комнатной температуре в течение около 30 мин. </li><li> Подготовка 1 мл 100 мкМ изопротеренола и соматостатина в RPMI-1640 с добавлением 10 мкл исходного раствора (10 мМ) в 990 мкл RPMI-1640. </li><li> Заполните соединение пластину дозирования 20 мкл в соответствующие лунки, как указано на рисунке 2. </li><li> Накройте соединение пластины с нарезанные прокалываемой печатью, чтобы избежать изменения в концентрации соединения в результате испарения, прежде чемили во время инкубации в системе CDS основе. </li><li> Пластина тензодатчика, наконечники, и соединение пластины в систему CDS основе. </li><li> Назовите пластину в CDS на базе программного обеспечения прибора. </li><li> Выберите соответствующий протокол. Протокол отредактированы для классификации с МНПК называется &quot;Agonist Неприлипающие клетки Малый Образец плиты RT 15 мин &#39;. К коробке протокола и выберите этот протокол в списке протоколов </li><li> Инициировать протокол, нажав «Пуск». </li><li> Интегрированная система струйная одновременно добавляет соединений во все лунки путем инъекции 5 мкл на лунку, чтобы достичь конечной концентрации 10 мкМ в общем объеме 50 мкл. </li><li> Система CDS на основе автоматически собирает данные в течение 15 мин после того соединения. </li></ol></li><li> Анализ данных <ol><li> Выберите низкие и высокие диапазоны частот для использования при расчете извлеченные значения для неприлипшие клетки. </li><li> Выберите коррекции дрейфа исправить линейное изменение измерений базовых импеданса в течение долгого времени. </li><li> Выберите фильтрацию данных, чтобы уменьшить различия в измерении кинетической реагирования в связи с электронным шумом и соединения того. </li><li> Выберите метод Макс-Мин на время полного анализа. </li><li> Экспорт данных в Excel под опцией формате пластина. </li><li> Рассчитать дельта G (ΔG) путем вычитания среднего значения АЧХ в Gi стимуляции (RmGi) от среднего ответа величине Gs стимуляции (RMGS) по следующей формуле: DG = RmGi - RMGS </li><li> Вычислить процент эффекта сгиба (Fe) ОПН на Gi-опосредованной реакции путем деления среднем АЧХ в Gi стимуляции в присутствии OPN (RmGiOPN) со средним АЧХ в желудочно-кишечном стимуляции в присутствии PBS ( RmGiPBS) по следующей формуле: Fe = 100 х (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Обратитесь к Тсостоянии 2 классифицировать пациентов. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence:+a+call+for+a+statement+of+terms.">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li><li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+screening+for+scoliosis.">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li><li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+idiopathic+scoliosis:+natural+history+and+long+term+treatment+effects.">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).</li><li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening.">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li><li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+screening+for+scoliosis:+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer?.">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?.</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoliosis+imaging:+what+radiologists+should+know.">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li><li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren:+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program.">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li><li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis.">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li><li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+scoliosis.">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li><li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li><li>Nash, C. L., Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis.">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Эта работа привела к несколько патентов держать на Сент-Жюстин университетской больницы и многие другие находятся на рассмотрении в нескольких странах. Четвертое измерение позвоночника ООО является эксклюзивным лицензиатом Sainte-Justine University Hospital.

Мы описали подробную процедуру прогностического теста на основе клеток для идиопатический сколиоз, применимой к мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) свежевыделенными или сохраняется заморозить на срок до одного года в жидком азоте. С помощью Свежевыделенные МНПК громоздко при тестировании большого количества лиц, процедура была представлена ​​с замороженными МНПК, которые предлагают более практичный вариант в клинических условиях. Тем не менее, были обнаружены проблемы с клеточной слипания при оттаивании, когда замороженные МНПК первоначально использовались, что приводит иногда к изменчивости между сериями. Чтобы максимизировать анализа воспроизводимости, мы рекомендуем избегать при замораживании-оттаивании цикл и использование замороженного образца только один раз. Процедура очень проста, что позволяет для точного обнаружения неисправного Gi функции белка в течение короткого времени. Используя эту процедуру, бессимптомные и сколиотические дети могут быть легко классифицированы, чтобы лучше прогнозировать их клинический исход без какой-либо опасности для их здоровья. Хогим при выполнении классификации по степени максимального ответ на Gi стимуляции относительно здоровых субъектов 12 контрольных, несколько требований к субъектам управления должны быть выполнены. Действительно, для того, чтобы иметь надлежащий сравнения когорту, субъекты управления должны быть возраст и пол совпадают, не быть на любом виде лекарств, а также обеспечить личную информацию, например, прошлого индивидуального / семейной истории болезни. Эти требования могут стать важным препятствием для найма контрольной. Поэтому, выполняя классификацию, исследуя степень дисбаланса между ответ на Gi и Gs стимуляции белка в той же особи идеально подходит для устранения необходимости использования вопросов управления. Использование системы CDS-основе для выполнения этой прогностическое испытание имеет важное значение с точки зрения одновременно обеспечивая GI-и Gs-опосредованных клеточных ответов в том же анализе. Хотя многие пациенты могут быть классифицированы, не утранеоднозначность, используя динамический диапазон, установленный для данного анализа, небольшое количество пациентов будет демонстрировать значения на границе диапазонов, как показано по результатам настоящего доклада. Чтобы различать этих людей, мы ввели оценку влияния ОПН на ответ на Gi стимуляции, продемонстрировав, что OPN индуцирует дифференциальный эффект на Gi-опосредованного клеточного ответа между тремя функциональными группами. В самом деле, мы обнаружили, что в присутствии ОПН, ответ на Gi стимуляции увеличения ПП1, в то время как она уменьшается в FG2 и FG3, в большей степени в FG2. Несмотря на высокую стоимость ОПН, использование этого хемокина важно различать неопределенных случаев и, следовательно, повысить точность классификации нашем анализе. Тем не менее, этот анализ имеет недостаток в том, что, как минимум, 1,5 х 10 5 клеток на лунку обязан соблюдать клеточный ответ с системой CDS основе в условиях нашего эксперимента. Некоторые образцы пациентов не будет иметь достаточного количестваклетки, которые будут обследованы. В этом случае, необходимо вспомнить пациентов для дополнительного сбора крови, который может быть тревожным для семей и разочарований для медицинского и лабораторного персонала. Перспективные исследования планируются в нашей лаборатории для решения этого вопроса. Тем не менее, текущий протокол опирается на простых и проверенных методов для подготовки клетки в то время как тестирование автоматизированной с использованием утвержденной системы без наклеек 13, 14 для контроля ответов клетки. Тестирование платформа является относительно недорогим по сравнению с генетической платформы, доступного для прогнозирования других заболеваний. Кроме того, стоимость всех расходных материалов, в том числе трубок для сбора крови, советы, специальной электрода микропланшетов и конической и пробирки Эппендорф, не очень дорого и оценивается в менее чем $ 3000, чтобы завершить тестирование на примерно одна тысяча пациентов. Хотя эта оценка не включает в себя затраты на оплату труда для подготовки образцови выполнив тест, этот тест значительно более доступным, чем платформах секвенирования следующего поколения остается. Обращает на себя внимание, это не только сравнение стоимости к генетическим платформах, но более конкретно относится к области АИС, это расходы, связанные с радиологических изображений. Сегодня, более чем одного миллиона детей в США и около 100 тысяч детей в Канаде с диагнозом идиопатический сколиоз, и общая стоимость диагностики и мониторинга сколиотических детей методом рентгеновской экспозиции составляет более 2,5 млрд. долларов в год в Северной Америке. Таким образом, наша процедура анализа на основе клеток можно было бы ожидать, чтобы быть пригодным для рутинного скрининга и мониторинга детей с идиопатическим сколиозом без риска для здоровья и с меньшими затратами.

Идиопатический сколиоз является деформацией позвоночника неизвестной причины обычно определяется как боковое искривление превышает 10 градусов, сопровождающихся позвонка вращения 1. Состояние влияет 4% от детского населения и чаще всего диагностируется в возрасте от 9 до 13 лет 2,3,4. Диагноз в первую очередь исключения и производится только после исключения других причин деформации позвоночника, таких как позвоночный пороков, нервно или синдромальных расстройств. Традиционно trunkal асимметрия раскрывается Адамс теста вперед гибки и измеряется сколиограф во время физической экспертизы 5. Диагноз может быть подтвержден рентгенографического наблюдения кривой и измерения угла с использованием способа Cobb 6. После постановки диагноза, главной задачей для врачей в управлении сколиотической детей в том, будет ли кривая прогресса. Действительно, кривые прогрессии, часто непредсказуемо иболее часто наблюдается среди девочек, чем у мальчиков 7. При отсутствии лечения, кривая может прогрессировать резко, создавая значительные физические деформации и даже сердечно-легочную проблемы. Эти проявления становятся опасными для жизни, когда кривая превышает 70 ° 8,9. Нынешние методы лечения, чтобы предотвратить или остановить прогрессирование кривой включают общеукрепляющим и хирургии. В общем, готовятся рекомендуется для кривых между 25-40 °, в то время как операция зарезервирован для кривых более 45 ° или не реагировать на крепления. Примерно, 10% детей с диагнозом идиопатического сколиоза у кривые прогрессии, требующий корректирующие операции 10. В настоящее время нет проверенный метод или тест, доступный для выявления этой категории пациентов. Следовательно, все диагностированные дети подвергаются нескольких рентгеновских снимков в течение нескольких лет, как правило, пока они не достигнут скелетной зрелости. Считается, что типичные пациенты с сколиозом будет иметьпримерно в 22 рентгенологические исследования над 3-летний период 11. Из-за потенциального риска нескольких рентгенографических исследований, альтернативные подходы, которые могут позволить выполнять прогноз идиопатический сколиоз, не подвергая детей к ионизирующей радиации сильно хочется. С целью удовлетворения этой потребности, мы уже разработали на основе клеток скрининге в качестве прогностического теста раньше выявить бессимптомные детей с риском развития идиопатический сколиоз. Тест предсказывает клинический исход в обеих бессимптомных и детей, пострадавших путем изучения функционального состояния Gi белков и классификации детей на три функциональные группы (ПП1, ПП2 и ПП3) в зависимости от степени максимального ответ на Gi белка стимуляции 12 как измеряется CDS на основе системы. Эта система в основном используется для оценки трансдукцию сигнала через G белков в клетках различных типов 13,14,15,16. Это дает информацию оОбщая интегрированы ответ клеток на внешние раздражители, измеряя изменения в импеданса после активации рецепторов клеточной поверхности. Клетки высевают в микропланшеты, которые содержат электроды в нижней части лунки и система применяет небольшое напряжение, которые вызывают внеклеточные и трансцеллюлярного токи. После соединения инъекции в скважину, рецепторы клеточной поверхности стимулируются и передачи сигнала события происходят, что приводит к клеточных изменений, которые влияют на поток внеклеточных и трансцеллюлярного токов, и тем самым влиять на измеренный величину. При таком подходе, сколиотическую пациенты и дети больше подвержены риску развития сколиоза менее чувствительны к Gi стимуляции белкового по сравнению с группой контроля, а также классификация основана на процентах от степени снижения по отношению к контрольной группе. Диапазоны классификации закреплены между 10 и 40% FG3, 40 и 60% для FG2 и 60 и 90% для ПП1 12. <p claсс = &quot;jove_content&quot;&gt; В последнее время, мы изменили этот подход, демонстрируя, что три функциональные группы четко можно выделить в соответствии с профилем дисбаланса между ответ на Gi и Gs стимуляции. В самом деле, мы обнаружили, что ответ на Gi стимуляции преобладали FG3, в то время как никакой очевидной дисбаланс не наблюдалось FG2. В противоположность этому, ПП1 выставлены преобладание ответа на Gs стимуляции. Кроме того, мы предоставили доказательства того, что пациенты, принадлежащие к FG2 больше подвержены риску развития точки нуждающихся хирургии 17. Точность этого теста классификации того, было улучшено путем демонстрации дифференциальный эффект остеопонтином (OPN) на ответ на Gi стимуляции среди функциональных групп. Здесь мы документировать подробные шаги экспериментальных и аналитических процедур этого функционального тестирования, как в настоящее время выполняется в нашей лаборатории.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Этот протокол детали экспериментальной и аналитической процедуры для клеточном анализе, разработанной в нашей лаборатории в качестве функционального теста, чтобы предсказать прогноз идиопатический сколиоз у бессимптомных и пострадавших детей. Анализ состоит из оценки функционального состояния Gi и Gs белков в мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) по сотовой диэлектрической спектроскопии (CDS), с использованием автоматического CDS на основе документа, а также классификацию детей на три функциональные группы (ПП1 , FG2, FG3) по отношению к профилю дисбаланс между степенью ответ на Gi и Gs белков стимуляции. Классификация подтверждается еще дифференциального эффекта остеопонтином (OPN) на ответ на Gi стимуляции среди групп и тяжелой прогрессирование заболевания ссылается FG2. Примерно, объем 10 мл крови необходимо извлечь РВМС на Ficoll-градиента и клетки затем хранили в жидком азоте. Достаточное количество PКонтроллеров BMC выполнять исследования получается после двух дней клеточной культуре. По существу, клетки сначала инкубировали с phytohemmaglutinin (ФГА). После 24 ч инкубации среду заменяли на ФГА, свободной от культуральной среде в течение дополнительных 24 часов до посева клеток и лечения ОПН. Затем клетки спектроскопии скрининг на своих ответах на соматостатина и изопротеренолом, которые соответственно активируют Gi и Г.С. белки через их родственными рецепторами. Оба соматостатин и изопротеренолом одновременно вводят с интегрированным гидросистемы и ответы клеток передаются контролируются в течение 15 мин. Анализ может быть выполнен с свежих или замороженных РВМС и процедура закончена в течение 4 дней.

Жизнеспособность клеток была сравнима среди всех образцов со значениями в соответствии в диапазоне от 86 и 96%. В противоположность этому, высокие вариации были отмечены в числе клеток среди образцов (таблица 3). Из 32 образцов, используемых, два имел недостаточное количество клеток и которые не были классифицированы. Пример результатов функциональной классификации по степени дисбаланса между Gi и сигнализации ГЦБ показал на рисунке 3. Вертикальная ось этой фигуры состоит из трех разделов разграничения функциональных групп с динамическим диапазоном, установленным как&gt; 10 для FG3, между 10 и -10 для FG2, и, наконец, &lt;-10 для ПП1. Среди 30 пациентов испытанных здесь, 14, 6, и 5 пациентов были четко разделены на FG3, FG2, и ПП1, соответственно, тогда как пять пациентов, в частности, 345, 353, 370, 371, и 382, ​​были в границы диапазонов. Оценка влияния OPN на ответ на Gi стимуляции показало, что OPN увеличил ответ в годовыхциентов 353 и 371. В противоположность этому, ответ был снижен более чем на 50% у пациентов 345 и 382 и менее чем на 50% в пациента после лечения 370 rOPN. Так, в соответствии с нашими критериями классификации (табл. 2), мы смогли классифицировать пациентов 353 и 371 ​​в ПП1, пациенты 345 и 382 в FG2, и пациент 370 в FG3. Параллельно, все пациенты были обследованы на их реакции на Gi стимуляции белкового и по сравнению с контрольной группой. Как и ожидалось, все пациенты были менее чувствительны, чем в контрольной, и пациенты, отнесенные к той же функциональной группы нашей новой процедуры выставлены аналогичные уровни максимальной реакции (рис. 5). Более того, разрыв между пациентами каждой функциональной группы согласуется с нашей классической диапазоне классификации 12, проверка наш новый порядок. Классификация большой когорты сколиотических пациентов регулярно следуют в нашей специальной клинике в Sainte-Justine больнице показало, что трифункциональные группы были аналогичным образом распределены среди умеренных случаях, в то время как FG2 был преобладающим среди тяжелых случаях (фиг. 6), идентификации пациентов разделить на данную функциональную группу, как более подвержены риску тяжелой прогрессирования заболевания и о том, что этот тест классификация может быть полезно в прогноз идиопатический сколиоз. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Решение </td><td> Безводный D-глюкозы </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 0,05 мм </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,98 мМ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 мМ </td></tr><tr><td> Трис </td><td> 145 мм </td></tr><tr><td> Раствор В </td><td> NaCl </td><td> 140 мм </td></tr><tr><td rowspan="2"> Сбалансированный солевой раствор (BSS) </td><td> Решение </td><td> 1 объем </td></tr><tr><td> Раствор В </td><td> 9 объем </td></tr><tr><tdRowSpan = &quot;3&quot;&gt; Полный СМИ </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 мл </td></tr><tr><td> Антибиотик-противогрибковое </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Дополнительные СМИ </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 мл </td></tr><tr><td> Антибиотик-противогрибковое </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Замораживание средств массовой информации </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 мл </td></tr><tr><td> Антибиотик-противогрибковое </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> ДМСО </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHA СМИ </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 мл </td></tr><tr><td> Антибиотик-противогрибковое </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohemaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Основныерешения. <table border="1"><tbody><tr><td> Динамические диапазоны с ΔG </td><td> Функциональные группы </td><td> Динамические диапазоны с Fe </td></tr><tr><td> ΔG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Фе&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG &lt;+10 </td><td> FG2 </td><td> Фе &lt;50% </td></tr><tr><td> ΔG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Классификация функциональных групп в соответствии с динамическим диапазоном, установленным с ΔG и Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Пациенты </td><td> Жизнеспособность (%) </td><td> Концентрация клеток (× 10 6 / мл) </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td> Недостаточное количество клеток </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> Недостаточное количество клеток </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ TD&gt; <td> 92,6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 3. Процент жизнеспособности и концентрации клеток, как определено с использованием автоматического счетчика клеток и жизнеспособность анализатора. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Рисунок 1. Дизайн для посева клеток. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Рисунок 2.Дизайн для дозирования соединений. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Рисунок 3. Динамический диапазон функциональной классификации с использованием системы CDS основе. График иллюстрирует значения степени дисбаланса между ответов на Gi и Gs стимуляции, полученной в МНПК пациентов с идиопатическим сколиозом. Значения были измерены с помощью системы CDS основе в ответ на 10 мкМ изопротеренола и соматостатин. Каждая точка представляет ΔG обеих реакций в двух экземплярах. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Рисунок 4. Влияние rOPN на ответ на Gi стимуляции в МНПК. Клетки с недостатком сыворотки в течение 18 часов в присутствии или в отсутствие 0,5 мкг / мл rOPN и затем стимулировали 10<html> 56; М соматостатина инициировать Gi-опосредованного клеточного ответа. Данные в графе были получены из максимальной-минимум сопротивления и соответствуют среднему ответ в двух экземплярах. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Рисунок 5. Функциональное состояние Gi белка в МНПК от контроля и scoliostic субъектов. РВМС от контрольных субъектов и сколиотических пациентов подвергались воздействию возрастающих концентраций соматостатина, чтобы стимулировать Gi белков с помощью эндогенных рецепторов соматостатина. Клеточный ответ измеряли системы CDS основе, как описано в разделе процедуры. Кривые были получены из максимума-минимума сопротивления. Каждая кривая представляет собой нелинейной регрессии. Данные были нормированы на максимальной реакции в клетках из контрольной и каждая точка соответствует среднему ответ в двух экземплярах./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок. <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Рисунок 6. Распределение функциональных групп среди различных этапах сколиоза. Большая когорта сколиотических пациентов с 794 умеренных (кривизны между 10-44 °) и 162 тяжелых (кривизны больше чем на 45 град) случаях регулярно следуют в Sainte-Justine больницы, были классифицированы в соответствии с их степенью дисбаланса между ответ на Gi и Gs стимуляция. Реакции были измерены с помощью системы CDS основе в ответ на 10 мкМ изопротеренола и соматостатин.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Структурированная протокол представлен на клеточном анализе как функционального тестирования предсказать прогноз идиопатический сколиоз с помощью сотового диэлектрической спектроскопии (CDS). Анализ может быть выполнен с свежих или замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), и процедура завершается в течение 4 дней.

Клеточная Протокол анализа для прогностического Прогнозирование идиопатический сколиоз с помощью сотового диэлектрической спектроскопии

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Экспериментальная парадигма прогнозирования послеоперационной боли (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

Трир социальной протокол стресс-тест для стимулирования психологического стресса

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Collection Protocol for Human Pancreas

Коллекция протокол для поджелудочной железы человека

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Фокус Образование: клеточном анализе для определения онкогенных потенциал гена

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Диффузный оптической спектроскопии для количественной оценки острой токсичности ионизирующей радиации, индуцированный кожи с помощью модели мыши

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Выявление ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1 с помощью системы сплит-люциферазы

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Количественная оценка площади поперечного сечения зрительного нерва на МРТ: новый протокол с использованием программного обеспечения Fiji

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...