Name: cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, Frankrike (till Dr Moreau), Den kanadensiska Institutes of Health Research (bevilja PP2-99.466 till Dr Moreau) och från Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (forskningsbidrag till Dr Moreau).

Hela proceduren utförs under sterila biologiska huva och alla lösningar och utrustning som kommer i kontakt med celler måste vara sterila. 1. Beredning av Viktiga lösningar <ol><li> Bered lösningar enligt tabell 1. </li><li> Håll balanserad saltlösning (BSS) vid rumstemperatur och alla andra lösningar vid 4 ° C fram till tidpunkten för användning. </li><li> Varm kall media till 37 ° C i vattenbad i några minuter innan du använder. </li></ol> 2. Beredning och lagring av PBMC <ol><li> Samla 10 ml helblod i EDTA-behandlade uppsamlingsrör för att framställa två alikvoter av PBMC med användning av 5 ml för varje alikvot. </li><li> Överför 5 ml av helblod från EDTA-behandlat uppsamlingsrör till ett 50 ml rör. </li><li> Tillsätt en lika volym av BSS och blanda provet genom försiktig pipettering upp och ned. </li><li> Placera 3 ml Ficoll i två 15 ml Falcon-rör. </li><li> Lagret försiktigt 4,5 mlav utspätt blod blandningen över Ficoll i varje rör. </li><li> Låt rören vila i upp till 5 minuter för att gynna en klar åtskillnad mellan blodet och Ficoll. </li><li> Centrifugera rören vid 400 xg under 30 minuter vid rumstemperatur utan broms. </li><li> Ta försiktigt bort rören från centrifugen för att inte störa den skiktning. De PBMC är synliga på BSS / Ficoll gränssnittet. </li><li> Skörda det grumliga skiktet av PBMC vid gränsytan mellan de båda rören med en pipett och överföra till ett nytt 50 ml rör. </li><li> Tillsätt 20 ml komplett medium. </li><li> Centrifugera röret vid 288 x g under 7 min vid rumstemperatur. </li><li> Avlägsna supernatanten genom aspiration. </li><li> Resuspendera cellpelleten i 500 l av kompletterande media. </li><li> Lägg till en lika stor volym frysmediet. </li><li> Överför cellsuspension till en cryovial. </li><li> Placera köldkärlet in i en cryofreezing behållare med isopropanol. </li><li> Förvara frysning behållaren vid -80 ° C över natten. </li><li> Transfer de frusna PBMC alikvot till flytande kväve för långtidslagring. </li></ol> 3. Funktionell analys 1. Dag 1 <ol><li> Placera delmängd från flytande kväve i vattenbad vid 37 ° C i en minut eller tills upptinad. </li><li> Överför cellsuspensionen i ett 50 ml rör med en steril pipett. </li><li> Tillsätt 15 ml komplett medium och centrifugera cellerna ner vid 200 xg under 5 min vid rumstemperatur. </li><li> Avlägsna supernatanten genom aspiration. </li><li> Suspendera försiktigt cellpelleten i 1 ml av PHA medier. </li><li> Komplettera volymen till 20 ml med samma media. </li><li> Cap röret löst så att luft kan komma in. </li><li> Låt röret över natten vid 37 ° C i en CO 2-inkubator att tillåta vilande lymfocyter att omvandla till snabbt förökar lymfoblaster. </li></ol> 2. Dag 2 <ol><li> Ta slangen ur inkubatorn, skruva locken helt och snurra celler nedåt på 200 xg under 5 minutervid rumstemperatur. </li><li> Avlägsna supernatanten genom aspiration. </li><li> Suspendera försiktigt cellpelleten i 1 ml av komplett medium. </li><li> Komplettera volymen till 20 ml med samma media. </li><li> Cap röret löst så att luft kan komma in. </li><li> Låt röret över natten vid 37 ° C i en CO2-inkubator för att expandera cellantal. </li></ol> 3. Dag 3 <ol><li> Få röret ut ur inkubatorn, skruv locken helt och snurra cellerna ner vid 200 xg under 5 min vid rumstemperatur. </li><li> Avlägsna supernatanten genom aspiration. </li><li> Tvätta cellerna två gånger med 10 ml av RPMI-1640 genom centrifugering vid 200 xg under 5 min vid rumstemperatur. </li><li> Försiktigt resuspendera cellpelleten i 600 l av RPMI-1640. </li><li> Mät cellkoncentration och viabilitet, med användning av en automatiserad cellräknare och viabilitet analysatorn. </li><li> Lägg till lämplig volym av RPMI-1640 för att anpassa sig till en cellkoncentration av 1,5 x 10 5 cells/20 pl. </li&gt; <li> Behandla celler med rekombinanta OPN (rOPN) eller vehikel (PBS) i 1,5 ml Eppendorf-rör. <ol><li> Överför 100 l cellsuspension till två sterila 1,5 ml Eppendorf-rör. </li><li> Lägg rOPN i ett rör till en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml. </li><li> Tillsätt en motsvarande volym PBS i den andra slangen. </li><li> Blanda försiktigt varje tillstånd genom att pipettera upp och ner två gånger med användning av en steril pipett inställd på 100 | il. </li></ol></li><li> Förbered litet prov 96 brunnar mikroplatta. <ol><li> Lägg 5 | il av RPMI-1640 till varje brunn. </li><li> Centrifugera plattan vid 200 x g under 3 min för att avlägsna eventuella luftbubblor. </li></ol></li><li> Seed de obehandlade celler liksom även celler behandlade med rOPN eller PBS. <ol><li> Innan du överför celler från röret till mikro försiktigt pipettera upp och ner en gång för att säkerställa en jämn suspension av celler. </li><li> Tillsätt 40 l av cellsuspension per brunn i fyra exemplar för obehandlade celler, i två exemplar för rOPN eller PBS behandlade celler. Refer till figur 1 för konstruktionen. Denna konstruktion gör att 12 patienter som ska testas på samma mikro. </li><li> Lämna cellplattan under sterila huven under 5 min för att tillåta cellerna att vila och sedimentera jämnt på botten av brunnen innan de placeras i inkubatorn. </li></ol></li><li> Inkubera plattan i 18 timmar vid 37 ° C i en CO2-inkubator för att optimera effekten av OPN. </li></ol> 4. Dag 4 <ol><li> Kör plattan med föreningar. <ol><li> Ta ut plåten ur kuvösen och stannar vid rumstemperatur i cirka 30 minuter. </li><li> Bered en ml av 100 | iM av somatostatin och isoproterenol i RPMI-1640 genom tillsats av 10 | il av stamlösning (10 mM) i 990 | il av RPMI-1640. </li><li> Fyll förening plattan genom att man avskaffar 20 fil i lämpliga brunnar som visas i figur 2. </li><li> Täck föreningen plattan med en förskuren genomstickbar tätning för att undvika förändringar i förening koncentration på grund av avdunstning innaneller under inkubation i CDS-baserat system. </li><li> Lastcell platta, pipettspetsar, och förening plattan i CDS-baserat system. </li><li> Namnge plattan i CDS-baserade instrument programvara. </li><li> Välj lämpligt protokoll. Protokollet redigerad för klassificering med PBMC kallas &#39;Agonist Icke vidhäftande celler Små provplattan RT 15 min. &quot; Gå till protokollrutan och markera detta protokoll i listan över protokoll </li><li> Initiera protokollet genom att klicka på &quot;Start&quot;. </li><li> Den integrerade flödessystemet samtidigt tillför föreningarna till alla brunnar genom att injicera 5 ul per brunn för att uppnå en slutlig koncentration av 10 pM i en total volym av 50 | il. </li><li> CDS-baserat system samlar automatiskt data i 15 min efter förening tillägg. </li></ol></li><li> Dataanalys <ol><li> Välj låga och höga intervall av frekvenser för att använda vid beräkning av extraherade värden för ickevidhäftande celler. </li><li> Välj driftkorrigering för att korrigera den linjära förändringen i baslinjemätningar impedans över tiden. </li><li> Välj datafiltrering för att minska variationer i den kinetiska respons mätningen på grund av elektroniskt brus och förening tillägg. </li><li> Välj Max-Min metod för tids fullständig analys. </li><li> Exportera data till Excel enligt alternativ plattformat. </li><li> Beräkna delta G (AG) genom att subtrahera medelrespons storleksordning Gi stimulering (RmGi) från medelvärdet av svaret magnitud till Gs-stimulering (RMG-kranarna) med användning av följande formel: AG = RmGi - RMG-kranarna </li><li> Beräkna procenten av vecket effekt (Fe) av OPN på Gi-medierat svar genom att dividera genomsnittet av respons magnitud till Gi-stimulering i närvaro av OPN (RmGiOPN) med genomsnittet av respons magnitud till Gi-stimulering i närvaro av PBS ( RmGiPBS) med användning av följande formel: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Se Tkunna 2 klassificera patienter. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence:+a+call+for+a+statement+of+terms.">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li><li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+screening+for+scoliosis.">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li><li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+idiopathic+scoliosis:+natural+history+and+long+term+treatment+effects.">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).</li><li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening.">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li><li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+screening+for+scoliosis:+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer?.">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?.</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoliosis+imaging:+what+radiologists+should+know.">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li><li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren:+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program.">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li><li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis.">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li><li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+scoliosis.">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li><li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li><li>Nash, C. L., Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis.">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Detta arbete ledde till att flera patent som innehas av Sainte-Justine University Hospital och många andra är under behandling i flera länder. Fourth Dimension Spine LLC har exklusiv licens för Sainte-Justine Universitetssjukhuset.

Vi har beskrivit ett detaljerat förfarande för en cellbaserad prognostiska test för idiopatisk skolios som gäller för perifera mononukleära blodceller (PBMC) nyligen isolerade eller bevaras fryst i upp till ett år i flytande kväve. Sedan använder nyligen isolerade PBMC är besvärligt när man testar stort antal individer, var proceduren presenteras med frysta PBMC som erbjuder ett mer praktiskt alternativ i klinisk miljö. Emellertid var problem med cellklumpning vid upptining stött när frysta PBMC ursprungligen användes, leder ibland till inter-assay variabilitet. För att maximera analys reproducerbarhet, rekommenderar vi att undvika frys-tö cykel och använda den frysta prov endast en gång. Proceduren är mycket enkel, vilket möjliggör exakt upptäckt av defekt Gi proteiners funktion på kort tid. Med hjälp av denna procedur, kan asymtomatiska och skolios barn lätt klassificeras att bättre förutsäga deras kliniskt resultat utan någon fara för deras hälsa. HoWever, när du utför klassificering enligt graden av maximal respons på Gi stimulering jämfört med friska kontrollpersoner 12, flera krav för kontrollpersoner bör uppfyllas. Ja, för att få en korrekt jämförelse kohort måste kontrollpersoner vara ålder och kön matchade, inte på någon form av medicinering, och ge privat information, till exempel tidigare individ / familjär sjukdomshistoria. Dessa krav kan utgöra ett stort hinder för rekrytering av kontrollpersoner. Därför utför klassificering genom att undersöka graden av obalans mellan svar på Gi och Gs-protein stimulans i samma individ är idealisk för att eliminera behovet av att använda kontrollpersoner. Användningen av CDS-baserat system för att utföra denna prognostiskt test är betydande i fråga om att samtidigt skapa Gi-och Gs-medierade cellulära svar i samma analys. Trots att många patienter kan klassificeras utan ambiguity användning av det dynamiska området som fastställts för denna analys, kommer ett litet antal patienter uppvisar värden vid gränslinjen för intervall, såsom visas av resultaten i föreliggande rapport. För att skilja dessa individer, har vi infört utvärderingen av effekten av OPN på svar på Gi stimulering genom att visa att OPN inducerar en differentiell effekt på Gi-medierad cellulär respons bland de tre funktionella grupper. I själva verket fann vi att i närvaro av OPN, svar på Gi stimulering ökningar FG1, medan den minskar i FG2 och FG3, i högre utsträckning i FG2. Trots de höga kostnaderna för OPN är viktigt att använda denna chemokine att skilja tvetydiga fall, och därmed förbättra noggrannheten i vår klassificering analys. Emellertid har denna analys en nackdel i att ett minimum av 1,5 x 10 5 celler per brunn krävs för att observera cellulära svaret med CDS-baserat system under våra experimentella betingelser. Vissa patientprover kommer inte att ha tillräckligt mångaceller som skall testas. I detta fall är det nödvändigt att erinra om de patienter för ytterligare blodinsamling, vilket kan vara oroande för familjer och frustrerande för den medicinska och laboratoriepersonal. Blivande studier planeras i vårt laboratorium för att behandla denna fråga. Ändå bygger det nuvarande protokollet på enkla och beprövade metoder för att förbereda celler medan testning automatiseras med hjälp av en validerad etikett fritt system 13, 14 för att övervaka cellernas svar. Testningen plattform är relativt billigt jämfört med genetisk plattform tillgänglig för prognosen av andra sjukdomar. Även kostnaden för allt engångsmaterial, inklusive blodprovsrör, tips, den speciella elektrodmikroplattor, och koniska och Eppendorf-rör, är inte särskilt dyrt och beräknas till mindre än $ 3000 för att slutföra ett test för cirka tusen patienter. Även om denna uppskattning inkluderar inte arbetskostnader för beredning av proveroch utför testet, förblir detta test betydligt billigare än nästa generations sekvenseringsplattformar. Anmärkningsvärt, inte bara jämfört med kostnaden för genetiska plattformar, men mer specifikt relaterade till området för AIS, är kostnader i samband med radiologisk avbildning. Idag är mer än en miljon barn i USA och omkring 100.000 barn i Kanada diagnosen idiopatisk skolios, och den totala kostnaden för diagnos och övervakning av de skolios barn genom röntgenexponeringen är över 2,5 miljarder dollar årligen i Nordamerika. Således skulle vår cellbaserade analysförfarandet förväntas vara lämpliga för rutinmässig screening och uppföljning av barn med idiopatisk skolios utan hälsorisk och till lägre kostnad.

Idiopatisk skolios är en ryggrad missbildning av okänd orsak definieras i allmänhet som en lateral krökning är större än 10 grader tillsammans med en vertebral rotation 1. Villkoret drabbar 4% av den pediatriska populationen och är oftast diagnostiseras i åldrarna 9 till 13 år 2,3,4. Diagnosen är främst av utslagning och görs först efter att utesluta andra orsaker till spinal missbildning såsom vertebral missbildning, neuromuskulära eller syndrom störningar. Traditionellt är det trunkal asymmetri avslöjades av Adams framåt böjningsprovning och mäts med scoliometer under fysisk undersökning 5. Diagnosen kan därefter bekräftas genom röntgenobservation av kurvan och vinkelmätningen med användning av Cobb-metoden 6. När väl diagnosen, är det primära målet för läkare att hantera skolios barn om kurvan kommer att utvecklas. I själva verket är kurvan progression ofta oförutsägbara ochär mer frekvent bland flickor än hos pojkar 7. Om den inte behandlas kan den kurvan utvecklas dramatiskt, skapa betydande fysisk deformitet och till och med hjärt-problem. Dessa manifestationer bli livshotande när kurvan överstiger 70 ° 8,9. De nuvarande behandlingsalternativ för att förhindra eller stoppa kurvan progression innefattar stagning och kirurgi. I allmänhet är bracing rekommenderas för kurvor mellan 25-40 °, och kirurgi är reserverad för kurvor som är större än 45 ° eller inte svarar på stagning. Ungefär 10% av barn med diagnosen idiopatisk skolios har kurvan progression kräver korrigerande operation 10. För närvarande finns det ingen beprövad metod eller test tillgängliga för att identifiera denna typ av patienter. Följaktligen är alla diagnostiserade barn som utsatts för flera röntgenbilder över flera år, oftast tills de når skelett mognad. Det uppskattas att den typiska patienter med skolios harcirka 22 röntgenundersökningar under en 3-årsperiod 11. På grund av den potentiella risken för flera röntgenundersökningar, de alternativa metoder som kan ge utföra prognosen av idiopatisk skolios utan att utsätta barn för joniserande strålning är starkt önskvärt. Med avsikt att tillgodose detta behov, har vi tidigare tagit fram en cellbaserad screening-analys som ett prognostiskt test för att snabbare identifiera de asymtomatiska barn som riskerar att utveckla idiopatisk skolios. Testet förutsäger kliniska resultat i såväl asymtomatiska och drabbade barn genom att undersöka den funktionella status Gi proteiner och klassificera barnen in i tre funktionella grupper (FG1, FG2 och FG3) beroende på graden av maximal respons på Gi protein stimulering 12 mätt med CDS baserat system. Detta system används i stor utsträckning för att bedöma signalöverföring via G-proteiner i olika celltyper 13,14,15,16. Det ger information omtotal integrerad cellernas respons till externa stimuli genom att mäta förändringar i impedans till följd av aktivering av cellytreceptorer. Celler sås i mikroplattor som innehåller elektroderna i botten av brunnarna och systemet tillämpar en liten spänning att inducera extracellulära och transcellulära strömmar. Följande förening injektion i brunnen, är receptorer på cellens yta stimuleras och signaltransduktionshändelser inträffar, vilket leder till cellförändringar som påverkar flödet av extracellulära och transcellulär strömmar, och därmed påverka den uppmätta storleken. Med denna metod, de skoliospatienter och barn större risk att utveckla skolios är mindre känsliga för Gi protein stimulering jämfört med friska kontrollpersoner, och klassificeringen bygger på den procentuella graden av minskning i förhållande till kontrollgruppen. De klassificerings intervallen är fasta mellan 10 och 40% för FG3, 40 och 60% för FG2, och 60 och 90% för FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; På senare tid har vi modifierat denna metod genom att visa att de tre funktionella grupper tydligt kan urskiljas enligt profilen av obalans mellan svar på Gi och Gs stimulering. I själva verket fann vi att svar på Gi stimulering dominerade i FG3, medan någon uppenbar obalans observerades i FG2. Däremot FG1 uppvisade dominans för svar på Gs stimulering. Dessutom har vi gett belägg för att patienter som tillhör FG2 löper större risk att utvecklas till den grad att behöva operation 17. Precisionen av denna klassificering test har ytterligare förbättrats genom att visa en differentiell effekt osteopontin (OPN) om svar på Gi stimulering bland funktionella grupper. Här dokumenterar vi de detaljerade stegen av experimentella och analytiska förfarandena i denna funktionstest som för närvarande utförs i vårt laboratorium.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Detta protokoll detaljer den experimentella och analysförfarandet för en cellbaserad analys som utvecklats i vårt laboratorium som ett funktionstest för att förutsäga prognosen för idiopatisk skolios i asymtomatiska och drabbade barn. Analysen innebär en bedömning av den funktionella statusen för Gi och Gs proteiner i perifera mononukleära blodceller (PBMC) genom cellulära dielektrisk spektroskopi (CDS), med hjälp av en automatiserad CDS baserat instrument, och klassificeringen av barn i tre funktionella grupper (FG1 , FG2, FG3) med avseende på profilen av obalans mellan graden av respons på Gi och Gs proteiner stimulans. Klassificeringen bekräftas ytterligare av den differentiella effekten av osteopontin (OPN) om svar på Gi stimulering bland grupper och allvarlig progressiv sjukdom refereras av FG2. Ungefär, är en volym av 10 ml blod krävs för att utvinna PBMC genom Ficoll-gradienten och cellerna lagras därefter i flytande kväve. Det tillräckligt antal PBMCs för att utföra analysen erhålls efter två dagar av cellodling. I huvudsak är celler först inkuberas med phytohemmaglutinin (PHA). Efter 24 h inkubation ersattes mediet av ett PHA fritt odlingsmedium under ytterligare 24 h före cellsådd och OPN behandling. Celler sedan spektroskopiskt screenas för deras svar på somatostatin och isoproterenol, som respektive aktiverar Gi och Gs proteiner genom deras besläktade receptorer. Både somatostatin och isoproterenol samtidigt injiceras med ett integrerat flödessystemet och cellernas svar övervakas i 15 min. Analysen kan utföras med färska eller frysta PBMC och förfarandet är avslutat inom 4 dagar.

Cellernas livsduglighet var jämförbar i samtliga prover med värden som är förenliga i intervallet 86 och 96%. I motsats härtill var höga variationer noterades i cellantal bland prover (tabell 3). Av de 32 prover som använts, två hade tillräckligt många celler och har inte klassificerats. Ett exempel på resultat från den funktionella klassificeringen enligt graden av obalans mellan Gi och Gs signalering visade i figur 3. Den vertikala axeln av denna siffra är indelad i tre sektioner avgränsar de funktionella grupperna med dynamiska intervall som har fastställts som&gt; 10 för FG3, mellan +10 och -10 för FG2, och slutligen &lt;-10 för FG1. Bland 30 patienter som testats här, var 14, 6, och 5 patienter tydligt delas in FG3, FG2 och FG1, respektive, medan fem patienter, särskilt 345, 353, 370, 371, och 382, ​​var på gränsen till intervall. Utvärderingen av OPN effekten på svar på Gi stimulering hade avslöjat att OPN ökade responsen i PAtienter 353 och 371. Däremot fick svar minskat med mer än 50% av patienterna 345 och 382 samt med mindre än 50% i patienten 370 efter rOPN behandling. Så, enligt vår klassificeringskriterier (tabell 2), kunde vi kategorisera patienter 353 och 371 i FG1, patienter 345 och 382 i FG2, och patienten 370 i FG3. Parallellt fick alla patienter screenas för deras svar på Gi protein stimulans och jämfört med kontrollpersoner. Som väntat, alla patienter var mindre känsliga än kontrollpersoner och patienter som klassificeras enligt samma funktionella grupp av vår nya förfarandet uppvisade liknande nivåer av det maximala svaret (Figur 5). Dessutom skillnader mellan patienter i varje funktionell grupp var i linje med vårt klassiska sortiment av klassificering 12, validera vår nya förfarandet. Klassificeringen av en stor kohort av skoliospatienter regelbundet följs i vår specialklinik på Sainte-Justine sjukhus har visat att de trefunktionella grupper på liknande sätt fördelas måttliga fall, medan FG2 var förhärskande bland svåra fall (Figur 6), identifiera patienter kategoriseras i denna funktionella grupp som större risk för allvarlig progressiv sjukdom och indikerar att denna klassificering test kan vara användbart i prognos av idiopatisk skolios. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Lösning A </td><td> Vattenfri D-glukos </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl2-2 H2O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Lösning B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Balanced Salt Solution (BSS) </td><td> Lösning A </td><td> 1 volym </td></tr><tr><td> Lösning B </td><td> 9 volym </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; Komplett media </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotisk </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Kompletterande medier </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotisk </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Frys media </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotisk </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHA media </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotisk </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Fytohemaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Essentiallösningar. <table border="1"><tbody><tr><td> Dynamiska intervall med AG </td><td> Funktionella grupper </td><td> Dynamiska intervall med Fe </td></tr><tr><td> AG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;AG &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> AG&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Kategorisering av funktionella grupper beroende på dynamiska intervall som har fastställts med AG och Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Patienter </td><td> Lönsamhet (%) </td><td> Cell-koncentration (x 10 6 / ml) </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11,64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90,5</td><td> 13,6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8,54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25,79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94,2 </td><td> 27,36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8,52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Otillräckligt antal celler </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8,92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8,28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12,75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7,51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9,36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95,1 </td><td> 16,94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92,3 </td><td> 13,89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7,67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7,84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2,2 </td><td> Otillräckligt antal celler </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15,69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10,9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19,93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88,8 </td><td> 10,68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16,86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15,67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93,1 </td><td> 9,99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13,57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19,86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8,46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14,82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23,06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11,82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89,1 </td><td> 7,73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Procent livskraft och cellkoncentration som fastställts med hjälp av en automatiserad cellräknare och livskraft analysator. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figur 1. Design for cellsådd. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figur 2.Plan för dispense föreningar. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figur 3. Dynamiska området för den funktionella klassificeringen med hjälp av CDS-baserat system. Diagrammet visar värden på graden av obalans mellan svaren på Gi och Gs stimulering erhållits i PBMC från patienter med idiopatisk skolios. Värdena mättes med CDS-baserat system som svar på 10 ^ M av somatostatin och isoproterenol. Varje punkt representerar AG av både svar i duplikat. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figur 4. Effekt av rOPN på svar på Gi stimulering i PBMC. Celler serumsvältes under 18 timmar i närvaro eller frånvaro av 0,5 ^ g / ml rOPN och stimulerades sedan med 10<html> 56, M av somatostatin att initiera Gi-medierad cellulär respons. Data i diagrammet genererades från maximum-minimum impedans och motsvara genomsnittet av svaret i två exemplar. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figur 5. Funktionell status Gi-protein i PBMC från kontroll och scoliostic ämnen. PBMC från kontrollpersoner och skolios patienter exponerades för ökande koncentrationer av somatostatin att stimulera Gi proteiner via endogen somatostatinreceptor. Den cellulära responsen mättes genom CDS-baserade system, såsom beskrivits i förfarandet sektion. Kurvor genererades från maximum-minimum impedans. Varje kurva representerar den icke-linjär regression. Data normaliserades till maximalt svar i celler från kontrollindivider och varje punkt motsvarar medelvärdet av svaret i duplikat./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figur 6. Fördelning av funktionella grupper mellan olika faser av skolios. En stor kohort av skoliospatienter med 794 måttlig (krökningar mellan 10-44 °) och 162 allvarliga (sned större än 45 °) fall regelbundet följt på Sainte-Justine sjukhuset, klassificerades enligt deras grad av obalans mellan svar på Gi och Gs stimulering. Svar mätt med CDS-baserat system som svar på 10 ^ M av somatostatin och isoproterenol.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Ett strukturerat protokoll presenteras för en cellbaserad analys som ett funktionstest för att förutsäga prognosen för idiopatisk skolios med hjälp av cellulära dielektrisk spektroskopi (CDS). Analysen kan utföras med färska eller frysta perifera mononukleära blodceller (PBMC) och förfarandet är avslutat inom 4 dagar.

Cell-baserade analysprotokoll för Prognostic Prediktion av idiopatisk Skolios Använda Cellular Dielektrisk spektroskopi

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

En experimentell paradigm för förutsägelse av postoperativ smärta (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

En metod för Murine Islet Isolering och subkapsulär Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

Den Trier Social Stress Test protokoll för att framkalla psykisk stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Collection Protocol for Human Pancreas

Insamling Protokoll för human pankreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Fokus Formation: En cellbaserad analys för att Bestäm onkogen potential av en gen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Diffus optisk spektroskopi för kvantitativ bedömning av akut joniserande strålning inducerad Skin toxicitet med hjälp av en musmodell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31-magnetisk resonansspektroskopi: ett verktyg för att mäta<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial oxidativ fosforylering Kapacitet i human skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Identifiera hämmare av HBx-DDB1 interaktion med hjälp av en Split Luciferase assay system

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Kvantifiering av optisk nerv tvärsnittsområde på MRI: Ett nytt protokoll med Fiji-programvara

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...