Name: measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

نود أن نشكر السيدة كريستين A. الشتاء للحصول على مساعدة فنية ممتازة. وأيد هذا العمل من قبل برنامج العلوم العصبية الأساسية للبرنامج NINDS جماعية البحوث، المعاهد الوطنية للصحة (Z01 NS002610).

وقد تم تطوير النهج وصفها هنا باستخدام أدوات معينة والأدوات والبرمجيات. لأن مختبرات لن يتم استخدام نفس الإعداد التجريبية وتعميم النهج حيثما كان ذلك ممكنا. 1. التجميد السريع الطريقة التحليلية إ?...

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

المنهج التحليلي القائم على المجهر الالكتروني المقدمة هنا يسمح للكشف، وتحديد، وتحديد الكميات من عدة عناصر ذات الأهمية البيولوجية، بما في ذلك نا، K، P، وخاصة الكالسيوم. ويمكن إجراء هذه التحاليل في التحت خلوية، أي داخل عضية، القرار بسبب القدرة على اكتشاف وتحديد هي...

أيونات الكالسيوم ويمكن القول إن الكيان إشارة الخلية الأكثر أهمية وتنوعا في علم الأحياء، ولعب دورا أساسيا في العمليات العادية متنوعة مثل انتقال متشابك والتعبير الجيني. من ناحية أخرى، والكالسيوم المهم أيضا في موت الخلايا. على وجه الخصوص، ورفع القيود الكالسيوم هو عامل أساسي في الإصابة العصبية في المخ والشلل الرعاش والزهايمر والأمراض العصبية الأخرى 3،5. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم كميا كيفية توزيع الكالسيوم داخل الخلايا، وكيف يتغير هذا المنبهات الفسيولوجية التالية أو المرضية في جسم المريض. معقد هذا الهدف من خلال حقيقة أن الكالسيوم يتم توزيعها بشكل حيوي بين دولتين المادية - الحرة في حل أو منضما إلى الركيزة - وأن تركيزات الكالسيوم الخلوية تغيير على مدى عدة أوامر من حجمها نتيجة التحفيز. في حين أن هناك العديد من المنهجيات المتقدمة المتاحة لتحليل الابهه الكالسيوم داخل الخلايا، وتحديد تركيزات الكالسيوم الكلي في حجرات داخل الخلايا المحددة يقتصر واقعيا لنهج واحد، وهما الإلكترون التحقيق التحليل الدقيق (EPMA). EPMA هو الاسلوب الذي الأزواج مطياف الأشعة السينية إلى المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). بندقية الإلكترون تيم يركز على القرطاسية وsubmicron التحقيق الإلكترون على المنطقة التحت خلوية من الفائدة والأشعة السينية المنبعثة عنصر محددة نتيجة القصف الإلكترون يتم جمعها وتحليلها (انظر المراجع 7، 4 للاستعراضات الفنية التفصيلية). وتشمل مزايا EPMA القرار على مستوى عضية واحدة وحساسية submillimolar. في الممارسة العملية، ومع ذلك، يتطلب EPMA cryotechniques المتخصصة والأجهزة لإعداد العينات وتحليلها. هنا، يتم وصف الأدوات والتقنيات والأدوات المناسبة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام EPMA. Intramitochondrial الكالسيوم ط خاصةnterest بسبب الدور الحاسم الذي الميتوكوندريا المسرحيات الزائد الكالسيوم في أمراض الاعصاب.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

في هذه المقالة موصوفة الأدوات والتقنيات والأدوات المناسبة لقياس الكمي للمحتوى عنصري داخل الخلايا باستخدام تقنية تعرف باسم المسبار الإلكترون التحليل الدقيق (EPMA). Intramitochondrial الكالسيوم هو التركيز بشكل خاص نظرا للدور الحيوي الذي تلعبه الزائد الكالسيوم الميتوكوندريا في أمراض الاعصاب. ويستند الأسلوب على تحليل الأشعة السينية ولدت في المجهر الإلكتروني (EM) من خلال التفاعل بين شعاع الالكترون مع العينة. من أجل الحفاظ على التوزيع الأصلي من عناصر إنتشاري في الإلكترون المجهري العينات، يتطلب EPMA &quot;cryofixation&quot; من الأنسجة يليها إعداد cryosections سامسونج. ويتم تجميد السريع للخلايا المستزرعة أو الثقافات شريحة عضوي النمط من قبل يغرق في الإيثان السائل تجميد أو عن طريق البطولات الاربع تجميد ضد كتلة معدنية باردة، على التوالي. Cryosections أبعاده يتم قطع 80 نانومتر سميكة جافة بسكين الماس في كاليفورنيا. -16076؛ C، التي شنت على الكربون / المغلفة pioloform شبكات النحاس، وcryotransferred في البرد EM باستخدام حامل cryospecimen المتخصصة. بعد المسح ورسم الخرائط البصرية في موقع ≤ -160 درجة مئوية، والإلكترون جرعة منخفضة، cryosections المجمدة رطب هي في -100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ~ تجميد المجفف. وتسجل الصور على مستوى عضية من cryosections المجففة، وأيضا في جرعة منخفضة، عن طريق كاميرا CCD بطيئة مسح والمناطق التحت خلوية من الفائدة المحددة للتحليل. يتم جمع الأشعة السينية المنبعثة من رويس من قبل ثابتة ومركزة وعالية الكثافة التحقيق الإلكترون عن طريق الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) مطياف، التي تتم معالجتها بواسطة الإلكترونيات المرتبطة بها، وقدم بوصفه الطيف بالأشعة السينية، وهذا هو، مؤامرة من كثافة الأشعة السينية مقابل الطاقة. برامج إضافية تسهل: 1) تحديد مكونات عنصري بحكم &quot;مميزة&quot; الطاقات الذروة وبصمة؛ و 2) التحليل الكمي من خلال استخراج المناطق الذروة / الخلفية. ويختتم هذه الورقة مع اثنين من الأمثلة التي توضح نموذجيةتطبيقات EPMA، واحدة في التي وفرت تحليل الكالسيوم الميتوكوندريا البصيرة الحاسمة في آليات الاصابة excitotoxic المواد وآخر كشفت أساس مقاومة نقص التروية.

الحفاظ على خلايا الدماغ عادة إصابة excitotoxic المواد نتيجة لإطلاق ناقل عصبي المرضية التي تحدث تحت ظروف الدماغية. كان EPMA حاسمة لاكتشاف كيفية قدرة الميتوكوندريا الخلايا العصبية لعزل كميات هائلة من الكالسيوم وراء آلية الإصابة. صورة مجهرية الإلكترون في الشكل 3 يوض?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

وتصف هذه الورقة تطبيق cryoanalytical المجهر الإلكتروني لقياس الكمي من مجموع محتوى الكالسيوم وتوزيعه في قرار التحت خلوية في العينات البيولوجية المحددة من الناحية الفسيولوجية.

قياس إجمالي الكالسيوم في الخلايا العصبية بواسطة الكترون مسبار الأشعة السينية التحليل المجهري

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

على نطاق واسع التسجيل من الخلايا العصبية بواسطة مجسات سيليكون المنقول في يتصرفون القوارض

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

تعريب كوروليس موقعا في الدماغ الماوس

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...