Name: measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सुश्री क्रिस्टीन ए विंटर्स धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम NINDS अंदर का रिसर्च प्रोग्राम, एनआईएच (Z01 NS002610) की बुनियादी तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया.

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण विशिष्ट उपकरणों, उपकरण और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विकसित किया गया था. प्रयोगशालाओं में एक ही प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग नहीं होगा, क्योंकि दृष्टिकोण जहां संभव सामान्यीकृत है. <p cla...

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	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप आधारित विश्लेषणात्मक विधि यहाँ प्रस्तुत पहचान का पता लगाने, और ना, कश्मीर, पी, और विशेष रूप से सीए सहित जैविक हित के कई तत्वों के quantitation के लिए अनुमति देता है. ये विश्लेषण, subcellular पर ब...

कैल्शियम आयनों synaptic प्रसारण और जीन अभिव्यक्ति के रूप में विविध रूप में सामान्य प्रक्रियाओं में एक आवश्यक भूमिका निभा रहा है, यकीनन जीव विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण और बहुमुखी संकेतन सेल इकाई हैं. दूसरी ओर, कैल्शियम कोशिका मृत्यु में भी उतना ही महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, कैल्शियम ढील स्ट्रोक में neuronal चोट में एक महत्वपूर्ण कारक है, पार्किंसंस, अल्जाइमर और अन्य neurodegenerative रोगों 3,5. इस प्रकार, यह कैल्शियम कोशिकाओं के भीतर वितरित किया जाता है कैसे मात्रात्मक समझने के लिए महत्वपूर्ण है, और कैसे यह शारीरिक या pathophysiological उत्तेजनाओं निम्न परिवर्तन. समाधान में नि: शुल्क या एक सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य - - और सेलुलर कैल्शियम की सांद्रता उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में परिमाण के कई आदेशों के साथ बदल कि इस लक्ष्य को कैल्शियम गतिशील रूप से दो शारीरिक राज्यों के बीच वितरित किया जाता है कि इस तथ्य से जटिल है. Fr के विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई उन्नत तरीके जबकि वहाँintracellular कैल्शियम EE, परिभाषित intracellular डिब्बों में कुल कैल्शियम की सांद्रता का दृढ़ संकल्प वास्तविक एक दृष्टिकोण, अर्थात्, इलेक्ट्रॉन जांच microanalysis (EPMA) तक सीमित है. EPMA कि जोड़े एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) के लिए एक एक्स - रे स्पेक्ट्रोमीटर एक तकनीक है. मंदिर इलेक्ट्रॉन बंदूक ब्याज और इलेक्ट्रॉन बमबारी का एक परिणाम के रूप में उत्सर्जित तत्व विशेष एक्स - रे की एक subcellular क्षेत्र पर एक स्थिर, submicron इलेक्ट्रॉन जांच केंद्रित (विस्तृत तकनीकी समीक्षा के लिए संदर्भ 7, 4 देखें) एकत्र की है और विश्लेषण कर रहे हैं. EPMA के लाभ एकल organelle स्तर के संकल्प और submillimolar संवेदनशीलता शामिल हैं. अभ्यास में, तथापि, EPMA नमूना तैयार करने और विश्लेषण के लिए विशेष cryotechniques और इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है. इधर, उपकरण, तकनीक और EPMA का उपयोग intracellular कैल्शियम की माप के लिए उपयुक्त साधन वर्णित हैं. Intramitochondrial कैल्शियम विशेष मैं का हैमहत्वपूर्ण भूमिका के कारण nterest कि neurodegenerative रोगों में mitochondrial कैल्शियम अधिभार नाटकों.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

इस अनुच्छेद में इलेक्ट्रॉन जांच microanalysis (EPMA) के रूप में जाना तकनीक का उपयोग उपकरण, तकनीक, और intracellular मौलिक सामग्री का मात्रात्मक मापन के लिए उपयुक्त साधन वर्णित हैं. Intramitochondrial कैल्शियम क्योंकि mitochondrial कैल्शियम अधिभार neurodegenerative रोगों में खेलता है कि महत्वपूर्ण भूमिका की एक विशेष ध्यान है. विधि एक्स - रे का विश्लेषण नमूना के साथ एक इलेक्ट्रॉन बीम की बातचीत से एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) में उत्पन्न पर आधारित है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूनों में प्रसारण तत्वों के मूल निवासी वितरण बनाए रखने के लिए, EPMA ultrathin cryosections की तैयारी द्वारा पीछा ऊतक की &quot;cryofixation&quot; की आवश्यकता है. संवर्धित कोशिकाओं या organotypic टुकड़ा संस्कृतियों का तेजी से ठंड क्रमश: एक ठंडी धातु ब्लॉक के खिलाफ तरल एटैन में या स्लैम ठंड के कारण जमने डुबकी द्वारा किया जाता है. Cryosections नाममात्र मोटी 80 एनएम सीए में एक हीरा चाकू के साथ सूखी काट रहे हैं. -16076, सी, कार्बन / pioloform लेपित तांबे ग्रिड पर मुहिम शुरू की है, और एक विशेष cryospecimen धारक का उपयोग कर एक क्रायो ईएम में cryotransferred. सी और कम इलेक्ट्रॉन खुराक ° ≤ -160 पर दृश्य सर्वेक्षण और स्थान मानचित्रण के बाद, जमे हुए हाइड्रेटेड cryosections फ्रीज सूखे ~ 30 मिनट के लिए -100 डिग्री सेल्सियस पर हैं. सूखे cryosections की organelle स्तर छवियों को एक धीमी गति से स्कैन सीसीडी कैमरा और विश्लेषण के लिए चयनित हित के subcellular क्षेत्रों के माध्यम से भी कम मात्रा में, दर्ज कर रहे हैं. एक स्थिर, ध्यान केंद्रित, उच्च तीव्रता इलेक्ट्रॉन जांच से ROIs से उत्सर्जित एक्स - रे एक ऊर्जा फैलानेवाला एक्स - रे (EDX) जुड़े इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा संसाधित स्पेक्ट्रोमीटर,, और एक एक्स - रे स्पेक्ट्रम के रूप में प्रस्तुत द्वारा एकत्र कर रहे हैं, वह है, एक ऊर्जा बनाम एक्स - रे तीव्रता की साजिश है. अतिरिक्त सॉफ्टवेयर की सुविधा: उनके &quot;विशेषता&quot; पीक ऊर्जा और फिंगरप्रिंट द्वारा मौलिक घटकों का 1) पहचान, और चोटी के क्षेत्रों / पृष्ठभूमि की निकासी के द्वारा 2) मात्रात्मक विश्लेषण. इस पत्र विशिष्ट उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि दो उदाहरणों के साथ समाप्तMitochondrial कैल्शियम विश्लेषण ischemia के प्रतिरोध के आधार से पता चला है कि excitotoxic चोट और एक अन्य के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की, जिनमें से एक में EPMA अनुप्रयोगों,.

मस्तिष्क कोशिकाओं को आमतौर पर इस्कीमिक स्थितियों के कारण होती है कि रोग neurotransmitter रिहाई का एक परिणाम के रूप में excitotoxic चोट बनाए. EPMA कैल्शियम की भारी मात्रा में पृथक neuronal mitochondria की क्षमता चोट के तंत्र का आधार कैसे ...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

इलेक्ट्रॉन जांच एक्स - रे Microanalysis द्वारा न्यूरॉन्स में कुल कैल्शियम का मापन

इस पत्र physiologically परिभाषित जैविक नमूनों में subcellular संकल्प में कुल कैल्शियम की मात्रा और वितरण की मात्रात्मक माप करने cryoanalytical इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णन है.

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

कृन्तकों व्यवहार में बड़े पैमाने पर चल सिलिकॉन जांच से न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

पहचाने गए न्यूरॉन्स और दूध पिलाने के व्यवहार से कैल्शियम सिग्नल के युगपत रिकॉर्डिंग ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

इमेजिंग Hypothalamic माउस मस्तिष्क स्लाइस की GFP टैग न्यूरॉन्स में कैल्शियम प्रतिक्रियाएँ

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का प्रयोग एक जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में neurites दृश्यमान करने के लिए प्राथमिक न्यूरॉन्स की तैयारी

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric व्यवहार में व्यक्तिगत ंयूरॉंस की कैल्शियम इमेजिंग Caenorhabditis एलिगेंस

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

माउस मस्तिष्क में लोकस का स्थानीयकरण

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...