Name: measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00
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Vorremmo ringraziare la signora Christine A. Winters per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Programma Neuroscienze di base del Intramurale Programma di Ricerca NINDS, NIH (Z01 NS002610).

L&#39;approccio qui descritto è stato sviluppato utilizzando strumenti specifici, strumenti e software. Dato che i laboratori non utilizzano lo stesso setup sperimentale l&#39;approccio è generalizzata, ove possibile. 1. Congelamento rapido Il metodo analitico descritto è assolutamente dipendente approcci criogenici per: 1) il &quot;cryofixation&quot; di cellule o tessuti in modo da preservare quantitativamente la distribuzione dei componenti del tessuto diffusi...

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

La base microscopio-analitiche elettrone qui presentato permette l&#39;individuazione, l&#39;identificazione e la quantificazione di diversi elementi di interesse biologico, compresi Na, K, P, e soprattutto Ca. Queste analisi possono essere effettuate a subcellulare, cioè, intra-organello, risoluzione a causa della capacità di localizzare e identificare le strutture di interesse in immagini di alta qualità di criosezioni preparati da campioni congelati rapidamente. Si noti che nessuna colorazione è tenuto a...

Gli ioni calcio sono senza dubbio l&#39;entità segnalazione cellulare più importante e versatile in biologia, gioca un ruolo fondamentale nei processi normali diversi come trasmissione sinaptica e l&#39;espressione genica. D&#39;altra parte, il calcio è ugualmente importante nella morte cellulare. In particolare, la deregolamentazione calcio è un fattore chiave nel danno neuronale in ictus, Parkinson, Alzheimer e altre malattie neurodegenerative 3,5. Pertanto, è estremamente importante capire quantitativamente come calcio è distribuito all&#39;interno delle cellule, e come questo cambia seguente stimoli fisiologici o patofisiologici. Questo obiettivo è complicato dal fatto che il calcio è distribuita dinamicamente tra due stati fisici - liberi in soluzione o legato ad un substrato - e che le concentrazioni di calcio cellulare commutati diversi ordini di grandezza a seguito di stimolazione. Mentre ci sono diverse metodologie avanzate disponibili per l&#39;analisi di free calcio intracellulare, la determinazione delle concentrazioni di calcio totale in compartimenti intracellulari definiti è realisticamente limitata ad un approccio, cioè, elettrone sonda microanalisi (EPMA). EPMA è una tecnica che le coppie uno spettrometro a raggi X di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). La pistola TEM elettronico si concentra una sonda elettronica submicronico fermo su una regione subcellulare di interesse e raggi X specifici degli elementi emessi a seguito del bombardamento di elettroni sono raccolti e analizzati (vedi riferimenti 7, 4 per dettagliate recensioni tecnici). I vantaggi di EPMA sono sola risoluzione a livello di organelli e sensibilità submillimolar. In pratica, tuttavia, richiede EPMA cryotechniques specializzati e strumentazione per la preparazione dei campioni e analisi. Qui sono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure di calcio intracellulare mediante EPMA. Calcio intramitocondriale è di i particolarinterest sul conto del ruolo fondamentale che gioca mitocondriali sovraccarico di calcio nelle malattie neurodegenerative.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

In questo articolo vengono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure quantitative di contenuti elementale intracellulare utilizzando la tecnica conosciuta come sonda di elettroni microanalisi (EPMA). Calcio intramitocondriale è una particolare attenzione per il ruolo fondamentale che il sovraccarico di calcio mitocondriale svolge nelle malattie neurodegenerative. Il metodo si basa sull&#39;analisi dei raggi X generato in un microscopio elettronico (EM) per interazione di un fascio di elettroni con il campione. Al fine di mantenere la distribuzione nativo di elementi diffusibili in campioni di microscopia elettronica, EPMA richiede &quot;cryofixation&quot; del tessuto seguita dalla preparazione di criosezioni ultrasottili. Rapido congelamento delle cellule in coltura o colture fetta organotipica viene effettuata da tuffo congelamento in etano liquido o sbattere congelamento contro un blocco metallico freddo, rispettivamente. Criosezioni nominalmente spessore 80 nm sono tagliati a secco con un coltello di diamante a ca. -16076, C, montato su carbonio / griglie di rame pioloform rivestite, e cryotransferred in un Cryo-EM utilizzando un supporto cryospecimen specializzato. Dopo l&#39;indagine visiva e mappatura posizione a ≤ -160 ° C e bassa dose di elettroni, criosezioni congelati-idrato sono liofilizzati a -100 ° C per ~ 30 min. Immagini a livello organello di criosezioni secchi sono registrati, anche a basse dosi, per mezzo di una telecamera CCD a lenta scansione e regioni subcellulari di interesse selezionato per l&#39;analisi. Raggi X emessi da ROI da una, concentrata, sonda di elettroni ad alta intensità stazionaria vengono raccolti da un raggi X a dispersione di energia (EDX) spettrometro, elaborato da elettronica associata, e presentata come spettro ai raggi X, cioè un appezzamento di intensità dei raggi X vs energia. Software aggiuntivo facilita: 1) l&#39;identificazione di componenti elementari dai loro &quot;caratteristici&quot; energie di picco e di impronte digitali, e 2) analisi quantitativa per estrazione delle aree dei picchi / sfondo. Questo documento si conclude con due esempi che illustrano tipiciApplicazioni EPMA, uno in cui l&#39;analisi di calcio mitocondriale disponibile una visione critica dei meccanismi di danno excitotoxic e un altro che rivelavano la base della resistenza ischemia.

Le cellule cerebrali tipicamente lesioni alle eccitotossico a seguito del rilascio di neurotrasmettitore patologica che si verifica in condizioni ischemiche. EPMA è stato fondamentale per scoprire come la capacità dei mitocondri neuronali di sequestrare enormi quantità di calcio è alla base del meccanismo di lesione. Il microscopio elettronico in Figura 3 illustra l&#39;aspetto di mitocondri in criosezioni liofilizzati di neuroni ippocampali rapidamente congelati dopo 30 minuti di esposizione ad uno...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X

Questo documento descrive l&#39;applicazione della microscopia elettronica cryoanalytical per la misurazione quantitativa del contenuto di calcio totale e la distribuzione a risoluzione subcellulare in campioni biologici fisiologicamente definiti.

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

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