Name: measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00
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私たちは、優れた技術支援のために氏クリスティーヌA.冬を感謝したいと思います。この作品は、NINDS学内研究プログラム、NIH（Z01 NS002610）の基本神経科学プログラムによってサポートされていました。

ここに記載されたアプローチは、特定の機器、ツールとソフトウェアを使用して開発されました。 Labsは、同じ実験を使用することはできませんので、アプローチは、可能な限り一般化されています。 1。急速凍結彼らは凍結の瞬間に生きている細胞であったように定量的に拡散性組織成分と化学元素の分布を保持する方法で、細胞または組織の1）「?...

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

ここに提示電子顕微鏡ベースの分析法をNa、K、P、および特にカルシウムを含む生物学的関心のあるいくつかの要素の検出、同定、および定量を可能にする。これらの分析は、急速凍結検体から調製した凍結切片の高品質の画像における関心構造を検索し、同定する能力により、すなわち 、内オルガネラ、解像度、細胞内で実施することができる。染色は、組織要素の位置を定量的に?...

カルシウムイオンはシナプス伝達および遺伝子発現などの多様などの通常のプロセスにおいて重要な役割を果たして、間違いなく生物学において最も重要かつ汎用性の細胞シグナリングエンティティである。一方、カルシウムは、細胞死にも同様に重要である。特に、カルシウム、規制緩和が行程の神経損傷の重要な要因であり、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患3,5。このように、カルシウムが細胞内でどのように分布しているかを定量的に理解することが非常に重要であり、これはどのように生理学的または病態生理学的刺激、以下の変更。溶液中の遊離又は基質に結合 - - 及び細胞内カルシウム濃度は、刺激の結果として数桁にわたって変化し、この目標は、カルシウムを動的つの物理状態との間で分配されるという事実によって複雑になる。 FRの分析に利用可能ないくつかの高度な方法論がありますが細胞内カルシウムをEE、定義された細胞内区画中の総カルシウム濃度の決定は、現実的に一つのアプローチ、すなわち、電子プローブマイクロアナライザ（EPMA）に制限される。 EPMAは、透過型電子顕微鏡（TEM）に結合するX線分析技術である。 TEMの電子銃は（詳細な技術レビューのための参考文献7,4を参照）は、対象の細胞内領域に静止し、サブミクロンの電子プローブを集束し、電子の衝突の結果として放出素子特有のX線を収集し、分析する。 EPMAの利点は、単一の細胞小器官レベルの解像度とsubmillimolar感度があります。しかし実際には、EPMAは、試料調製および分析のための専門cryotechniquesや計測が必要です。ここでは、EPMAを用いた細胞内カルシウムの測定のための適切なツール、技術および器具が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムは、特別のIです神経変性疾患におけるミトコンドリアのカルシウム過負荷果たしている重要な役割の都合nterest。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

この記事では、電子プローブ微量分析（EPMA）として知られている技術を用いて、細胞内の元素含有量の定量的測定のための適切なツール、技術および機器が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムが原因ミトコンドリアカルシウム過負荷が神経変性疾患で果たす重要な役割の特定の焦点となっています。方法は、X線の分析に基づいて試料の電子ビームの相互作用によって電子顕微鏡（EM）で生成された。電子顕微鏡標本における拡散元素の天然分布を維持するために、EPMAは、超薄凍結切片の調製に続いて​​組織の「低温固定」を必要とする。培養細胞または器官型スライス培養物の急速凍結は、液体エタン、またはそれぞれ、冷たい金属ブロックに対して凍結により凍結スラムプランジによって行われる。凍結切片名目上80膜厚は、CAでダイヤモンドナイフを用いたドライカットされます。 -16076 Cは、炭素/ PIOLOFORM被覆銅グリッド上にマウントされ、専門cryospecimenホルダを用いて低温EMにcryotransferred。 ≤-160℃、低電子線量で視覚的な調査と位置マッピングした後、凍結した水和凍結切片を凍結乾燥〜30分間-100℃である。乾燥した凍結切片のオルガネラレベルの画像は、スロースキャンCCDカメラおよび分析のために選択された関心対象の細胞内領域を用いて、低用量で、記録される。静止した、集束高輝度電子プローブによりROIをから出射X線はエネルギー分散型X線（EDX）関連する電子機器によって処理分析計、およびX線スペクトルとして提示することによって収集される、すなわち、エネルギー対のX線強度のプロット。追加のソフトウェアは容易に：彼らの「特性」のピークエネルギーと指紋による元素成分の1）の識別、およびピーク面積/背景の抽出による2）定量分析。本稿では、典型的な例証2の例で締めくくりEPMAアプリケーション、ミトコンドリアのカルシウム分析は、虚血耐性の基礎を明らかにした興奮毒性損傷し、別のメカニズムに重要な洞察を提供している1。

脳細胞は通常、虚血状態下で起こる病的な神経伝達物質の放出の結果として、興奮毒性損傷を維持する。 EPMAはカルシウムを大量に隔離する神経細胞のミトコンドリアの能力は、損傷のメカニズムの基礎となる方法を発見する重要でした。 図3の電子顕微鏡写真は、急速に興奮毒性刺激（100μMNMDA）へ30分間曝露した後に凍結培養海馬ニューロンの凍結乾燥した凍結切片におけるミ?...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

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Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

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Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

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低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

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同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

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Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

マウスの脳、青斑核の局在

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...