Name: measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00
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우리는 우수한 기술 지원을 부인 크리스틴 A. 윈터스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램, NIH (Z01 NS002610)의 기본 신경 과학 프로그램에 의해 지원되었다.

여기에 설명 된 접근 방식은 특정 악기, 도구 및 소프트웨어를 사용하여 개발되었다. 실험실이 같은 실험 장치를 사용하지 않기 때문에 접근이 가능한 일반화되어있다. 1. 급속 냉동 그들이 동결 순간 생균에 있었던 것에 정량적 확산 조직 성분 및 화학 원소의 분포를 유지하는 방식으로 세포 또는 조직의 하나) &quot;cryofixation&quot;설명하는 분석 방법에 대?...

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

전자 현미경 기반의 분석 방법 여기에 제시된는 탐지, 식별, 그리고 나, K, P, 특히 칼슘 등의 생물학적 그 몇 가지 요소, 정량 할 수 있습니다. 이러한 분석은, 세포 내에서 수행 될 수있다, 즉, 인트라 소기관, 급속 냉동 검체로부터 제조 저온부의 고품질 이미지에 대한 관심의 구조를 찾아 식별하는 능력 때문에 해상도. 전혀 오염이 조직 요소의 위치를​​ 정량적으로 보존 상태에서도, 종?...

칼슘 이온은 시냅스 전달 및 유전자 발현 등 다양한 통상의 공정에서 필수적인 역할을 논증 생물학에서 가장 중요하고 다양한 세포 신호 전달 실체이다. 한편, 칼슘은 세포 죽음에서 동등하게 중요하다. 특히, 칼슘 규제 완화 뇌졸중의 신경 세포의 손상에 중요한 요소이다, 파킨슨 병, 알츠하이머 병 등 신경 퇴행성 질환 3,5. 따라서, 칼슘이 세포 내에서 어떻게 분포되는지를 정량적으로 이해하는 것이 매우 중요하고, 어떻게 이런 일이 생리적 또는 병태 생리 학적 자극을 다음과 같이 변경합니다. 용액에 무료 또는 기판에 결합 - - 셀룰러 칼슘 농도는 자극의 결과로서 수십배 이상 변경이 그 목표는 칼슘 동적 개의 물리적 상태 사이에서 분포되어 있다는 사실에 의해 복잡하게된다. FR의 분석에 사용할 수있는 여러 가지 고급 방법론이 있지만세포 내 칼슘을 전자, 정의 세포 내 구획에서 총 칼슘 농도의 결정은 현실적으로 한 가지 방법, 즉, 전자 탐침 미세 분석 (EPMA)로 제한됩니다. EPMA 그 커플 투과형 전자 현미경 (TEM)에 대한 X-선 분광계 기술이다. TEM 전자총 관심 및 전자 충격의 결과로서 발광 소자 고유의 X-레이의 세포 내 영역에 고정, 서브 마이크론 전자 탐침을 포커스는 (상세한 기술 리뷰를 참고 7, 4 참조)를 수집 및 분석된다. EPMA의 장점은 하나의 세포 기관 수준의 해상도와 submillimolar 감도 있습니다. 그러나 실제로, EPMA 시편 준비 및 분석을위한 전문 cryotechniques 및 계측을 필요로한다. 여기에, 도구, 기술 및 EPMA를 사용하여 세포 내 칼슘의 측정을위한 적절한 도구가 설명되어 있습니다. Intramitochondrial 칼슘은 특별 난입니다중요한 역할의 계정에 nterest하는 신경 퇴행성 질환에서 미토콘드리아 칼슘 과부하 재생됩니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

이 문서에서는 전자 프로브 미량 분석 (EPMA)로 알려진 기술을 사용하여 도구, 기술 및 세포 내 원소 함량의 정량적 측정을위한 적절한 도구가 설명되어 있습니다. Intramitochondrial 칼슘 때문에 미토콘드리아 칼슘 과부하가 신경 퇴행성 질환에서 활약하는 중요한 역할의 특정 초점이다. 방법은 X-선 분석 시료와 전자빔의 상호 작용에 의해 전자 현미경 (EM)에서 생성에 기초한다. 전자 현미경 표본의 확산 요소의 기본 분포를 유지하기 위해서, EPMA는 극박 저온부의 제조이어서 조직 &quot;c​​ryofixation&quot;를 필요로한다. 배양 된 세포 또는 Organotypic 슬라이스 문화의 급속 냉동은 각각 차가운 금속 블록에 액체 에탄 또는 슬램 냉동 동결 급락에 의해 수행된다. 저온부는 공칭 두께의 80 나노는 캘리포니아에서 다이아몬드 나이프로 건조 절단됩니다. -16076, C는 탄소 / pioloform 코팅 된 구리 그리드 상에 장착하고, 전문 cryospecimen 홀더를 사용하여 극저온-EM에 cryotransferred. C 낮은 전자 선량 ° ≤ -160에서 시각적 조사 및 위치 매핑 한 후, 냉동 수화 저온부는 동결 건조 ~ 30 분 -100 ° C에있다. 건조 저온부의 세포 기관 수준의 이미지는 느린 스캔 CCD 카메라와 분석을 위해 선택한 그 세포 내 영역에 의해, 또한 낮은 복용량에 기록됩니다. 문구, 집중, 고강도 전자 프로브의 ROI에서 출사 X-선은 에너지 분산 X-선 (EDX)에 연결된 전자 장치에 의해 처리 분광계, 및 X-선 스펙트럼으로 제시에 의해 수집되는, 즉, 에너지 대 X-선 강도의 줄거리. 추가 소프트웨어를 용이하게 : 자신의 &quot;특징&quot;피크 에너지와 지문에 의한 원소 성분의 1) 식별하고, 피크 면적 / 배경의 추출 2) 정량 분석​​. 이 논문은 일반적인 설명 두 가지 예와 결론미토콘드리아 칼슘 분석 허혈 저항의 근거를 제시 흥분 독성 손상 및 다른 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하는 하나의 EPMA 응용 프로그램.

뇌 세포는 일반적으로 허혈성 조건에서 발생 병리 신경 전달 물질 방출의 결과로서 흥분 독성 손상 서스테인. EPMA 칼슘 막대한 양의를 격리 할 수​​있는 신경 세포의 미토콘드리아의 기능이 손상의 메커니즘을 이루는 방법을 발견에 매우 중요했다. 그림 3의 전자 현미경 사진은 빠르게 흥분 독성 자극 (100 μM NMDA)에 30 분 노출 후 냉동 배양 해마 신경 세포의 동결 건조 저온부에있는 ...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

전자관 X-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정

이 논문은 생리 학적으로 정의 된 생물 표본의 세포 이하의 해상도에서 총 칼슘 함량과 분포의 정량적 측정에 cryoanalytical 전자 현미경의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

설치류를 행동에 이동 가능한 실리콘 프로브에 의한 뉴런의 대규모 녹화

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

쥐의 뇌에서 로커 스 Coeruleus의 지역화

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...