Name: measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

Vi vill tacka Ms Christine A. Winters för utmärkt tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av det grundläggande neurovetenskap Program för NINDS Interna Research Program, NIH (Z01 NS002610).

Den metod som beskrivs här har utvecklats med hjälp av särskilda instrument, verktyg och programvara. Eftersom labb inte kommer att använda samma experimentuppställning inflygningen generaliserad där så är möjligt. 1. Snabb nedfrysning Den analysmetod som skall beskrivas är absolut beroende av kryogena metoder för: 1) den &quot;cryofixation&quot; hos celler eller vävnader på ett sätt som kvantitativt bibehåller fördelningen av diffunderbart vävnads...

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Den elektronmikroskop baserade analysmetod presenteras här möjliggör detektion, identifiering och kvantifiering av flera delar av biologiskt intresse, bland Na, K, P, och i synnerhet Ca. Dessa analyser kan utföras på subcellulära, dvs intra-organell, upplösning på grund av möjligheten att lokalisera och identifiera strukturer av intresse i bilder av kryosnitt framställda från snabbt frysta prover av hög kvalitet. Observera att ingen färgning är nödvändig för att registrera elektronbilder jämf?...

Kalciumjoner är utan tvekan den viktigaste och mest mångsidiga enhet cellsignalering i biologi, spelar en viktig roll i normala processer så olika som synaptisk transmission och genuttryck. Å andra sidan, är lika viktigt i celldöd kalcium. Framför allt är kalcium avreglering en nyckelfaktor i neuronal skada vid stroke, Parkinsons, Alzheimers och andra neurodegenerativa sjukdomar 3,5. Därför är det oerhört viktigt att förstå kvantitativt hur kalcium distribueras inom celler, och hur detta förändras efter fysiologiska eller patofysiologiska stimuli. Detta mål kompliceras av det faktum att kalcium är dynamiskt fördelade mellan två fysikaliska tillstånd - fria i lösning eller bundna till ett substrat, - och det cellulära kalciumkoncentrationer förändras över flera storleksordningar som en följd av stimulering. Även om det finns flera avancerade metoder som finns för analys av free intracellulär kalcium, är fastställandet av den totala kalciumkoncentrationer i definierade intracellulära fack realistiskt begränsat till en strategi, nämligen elektronsondmikroanalys (EPMA). EPMA är en teknik som kopplar en röntgenspektrometer med ett transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM elektronkanon fokuserar en stationär, submikron elektron sond på en subcellulär område av intresse och elementspecifika röntgenstrålning som avges som ett resultat av elektronbombardemang samlas och analyseras (se referenser 7, 4 för detaljerade tekniska recensioner). Fördelar med EPMA omfattar singel organellnivå upplösning och submillimolar känslighet. I praktiken kräver dock EPMA specialiserade cryotechniques och instrumentering för extraktion och analys. Här är de verktyg, tekniker och instrument som är lämpliga för mätning av intracellulär kalcium med hjälp av EPMA beskrivs. Intramitochondrial kalcium är av särskilt interest på grund av den kritiska roll som mitokondriella kalciumöverbelastning spelar i neurodegenerativa sjukdomar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

I den här artikeln de verktyg, tekniker och instrument som är lämpliga för kvantitativa mätningar av intracellulär elementärt innehåll med hjälp av teknik som kallas elektron sond mikroanalys (EPMA) beskrivs. Intramitochondrial kalcium är ett särskilt fokus på grund av den kritiska roll som mitokondrie kalciumöverbelastning spelar i neurodegenerativa sjukdomar. Metoden är baserad på en analys av röntgenstrålar som genereras i ett elektronmikroskop (EM) genom interaktion av en elektronstråle med provet. För att upprätthålla den inhemska distributionen av diffunderbara element i elektronmikroskopiska exemplar, kräver EPMA &quot;cryofixation&quot; av vävnad följt av beredningen av ultratunna kryosnitt. Snabb nedfrysning av odlade celler eller organotypic skiva kulturer utföres genom dopp frysning i flytande etan eller av slam frysning mot en kall metallblock, respektive. Kryosektioner nominellt 80 nm tjockt skärs torrt med en diamant kniv vid ca. -16076, C, monterat på kol / pioloform belagda koppargaller, och cryotransferred in en Cryo-EM med hjälp av en specialiserad cryospecimen hållare. Efter visuell undersökning och lokalisering kartläggning vid ≤ -160 ° C och låg elektrondosen, frysta hydrerad kryosnitt frystorkas vid -100 ° C under ~ 30 min. Organelle nivå bilder av torkade kryosnitt registreras, även vid låga doser, med hjälp av en långsam-scan CCD-kamera och subcellulära regioner av intresse som väljs för analys. Röntgen avges från ROI av en stationär, fokuserad, högintensiva elektronsond samlas in av en energiröntgen (EDX) spektrometer, behandlas av tillhörande elektronik, och presenteras som ett röntgenspektrum, dvs en tomt på röntgenintensitet kontra energi. Ytterligare programvara underlättar: 1) identifiering av elementära delar av sina &quot;karakteristiska&quot; peak energier och fingeravtryck, och 2) kvantitativ analys genom extraktion av toppareor / bakgrund. Denna uppsats avslutas med två exempel som visar typiskaEPMA applikationer, en där mitokondrie kalcium analys som kritisk insikt i mekanismer för excitotoxisk skador och en annan som avslöjade grunden för ischemi motstånd.

Hjärnceller upprätthålla normalt excitotoxisk skada till följd av den patologiska neurotransmittorfrisättning som sker under ischemiska förhållanden. EPMA var avgörande för att upptäcka hur kapaciteten av neuronala mitokondrier att binda stora mängder kalcium ligger bakom mekanismen för skada. Den elektronmikrofotografi i figur 3 illustrerar uppträdandet av mitokondrier i frystorkade kryosnitt av odlade hippocampusneuroner snabbt frysts efter 30 min exponering för ett excitotoxiskt stimulu...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Mätning av totalt kalcium i nervceller från Electron Probe röntgenmikroanalys

Detta dokument beskriver tillämpningen av cryoanalytical elektronmikroskopi för kvantitativ mätning av totalt kalcium innehåll och fördelning vid subcellulär upplösning i fysiologiskt definierade biologiska prover.

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Storskalig inspelning av nervceller av lös Silicon sönder i Agera Gnagare

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Samtidig Registrering av Kalcium Signaler från identifierade nervceller och Utfodring beteende Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Beredning av primär nervceller för Visualisering neuriter i en Frozen-hydrerad stat Använda Cryo-elektrontomografi

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Lokalisering i Locus coeruleus i mus hjärnan

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...