Name: measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

Biz mükemmel teknik yardım için Bayan Christine A. Winters teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, NIH (Z01 NS002610) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan yaklaşım özel araçlar, araçlar ve yazılımlar kullanarak geliştirilmiştir. Laboratuvarları, aynı deney düzeneği kullanarak olmayacak çünkü yaklaşım mümkün jeneralize. 1.. Hızlı Dondurma Bu dondurma anda canlı hücrelerde olduğu gibi nicel yayılabilir doku bileşenleri ve kimyasal elementlerin dağılımını koruyan bir şekilde hücreler ya da dokuların 1) &quot;cryofixation&quot;: tarif edilecek olan analitik yöntem i?...

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Elektron mikroskobu tabanlı bir analitik yöntem, burada sunulan saptama, tanımlama ve Na, K, P, Ca ve özellikle de dahil olmak üzere biyolojik ilgi çeşitli elemanları, miktar tayini için olanak sağlar. Bu analizler, hücre içi de gerçekleştirilebilir, yani, intra-organel, hızlı bir şekilde dondurulmuş numuneler hazırlanmış kriyo seksiyonlarda yüksek kaliteli görüntüler ilgi yapıları bulmak ve tespit etmek yeteneği sayesinde çözünürlük. Boyanma dokusu elemanlarının yer nicel ola...

Kalsiyum iyonları sinaptik iletimi ve gen ifadesi olarak çeşitli normal süreçlerde önemli bir rol oynuyor, belki biyolojideki en önemli ve çok yönlü hücre sinyal varlık vardır. Öte yandan, kalsiyum hücre ölümünde de eşit derecede önemlidir. Özellikle, kalsiyum serbestleşme inme nöronal yaralanmaya önemli bir faktördür, Parkinson hastalığı, Alzheimer ve diğer nörodejeneratif hastalıklar 3,5. Böylece, kalsiyum hücre içinde nasıl dağıtıldığı kantitatif anlamak için son derece önemlidir ve nasıl bu fizyolojik veya patofizyolojik uyaranlara aşağıdaki değiştirir. Çözelti içinde serbest veya bir substrata bağlanmış - - ve hücresel kalsiyum konsantrasyonları stimülasyon bir sonucu olarak, birkaç büyüklük içinde değişebilir, bu amaç, kalsiyum dinamik olarak iki fiziksel durumlar arasında dağıtılır gerçeği ile karmaşıktır. Fr analizi için çeşitli yöntemler gelişmiş olsa da,hücre içi kalsiyum ee, tanımlanmış hücre içi bölümlerinde toplam kalsiyum konsantrasyonları belirlenmesi gerçekçi bir yaklaşımda, yani elektron probu mikroanaliz (EPMA) ile sınırlıdır. EPMA bu çiftler, bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile bir X-ışını spektrometresi bir tekniktir. TEM elektron tabancası ilgi ve elektron bombardımanı sonucunda yayılan eleman özgü X-ışınları bir alt hücresel bölgede sabit, Mikronaltı elektron prob odaklanır (ayrıntılı teknik değerlendirmeleri için başvurular 7, 4&#39;e bakın) toplanır ve analiz edilir. EPMA Avantajları tek organel düzeyinde çözünürlüğe ve submillimolar hassasiyet vardır. Ancak uygulamada, EPMA numune hazırlanması ve analizi için özel cryotechniques ve aletleri gerektirir. Burada, araçlar, teknikler ve EPMA kullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümleri için uygun araçlar açıklanmıştır. Intramitokondriyal kalsiyum özel i olankritik rol nedeniyle nterest bu nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal kalsiyum aşırı çalış.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

Bu yazıda Electron Probe Micro (EPMA) olarak bilinen teknik kullanılarak araçlar, teknikler ve hücre içi element içeriği nicel ölçümü için uygun bir alet açıklanmaktadır. Intramitokondriyal kalsiyum nedeniyle mitokondriyal kalsiyum aşırı nörodejeneratif hastalıklarda oynadığı kritik rolü belli bir odak noktasıdır. Yöntem, X-ışınları analizi örnek ile bir elektron ışını etkileşimi ile bir elektron mikroskobu (EM) oluşturulur dayanmaktadır. Elektron mikroskobu örneklerinde yayılabilir elemanlarının yerel bir dağılımının muhafaza edilmesi için, ultra ince EPMA cryosections hazırlanması ve ardından doku &quot;cryofixation&quot; gerektirir. Kültürlenmiş hücreler ya da Organotipik dilim kültürlerinin hızlı dondurma sırasıyla soğuk metal bloğun karşı sıvı etan veya çarpma dondurma ile dondurma dalma ile gerçekleştirilir. Kriyokesitler nominal kalınlığında 80 nm ca bir elmas bıçakla kuru kesilir. -16076, C, karbon / pioloform kaplı bakır ızgaralar üzerine monte edilmiş ve özel bir cryospecimen tutucu kullanarak cryo-EM içine cryotransferred. C ve düşük elektron doz ≤ ° -160 görsel ve diğer yer haritalama sonra, dondurulmuş hidratlanmış cryosections dondurularak kurutuldu, ~ 30 dakika boyunca 100 ° C altındadır. Kuru cryosections of organel düzey görsel yavaş tarama CCD kamera ve analiz için seçilen ilgi hücre içi bölgeleri ile, aynı zamanda, düşük bir dozda, kaydedilir. Bir sabit, odaklanmış, yüksek yoğunluklu elektron probu ile ROI yayılan X-ışınları, bir enerji dağıtıcı X-ray (EDX) ilişkili elektroniği tarafından işlenir spektrometresi, ve bir X-ışını spektrumu olarak sunulan toplanır, yani, bir enerji vs X-ışını yoğunluğu arsa. Ek yazılım kolaylaştırır: onların &quot;karakteristik&quot; pik enerjileri ve parmak izi ile elemental bileşenlerin 1) kimlik ve pik alanları / arka plan çıkarma 2) kantitatif analizi. Bu kağıt tipik gösteren iki örnek ile sona eriyorMitokondriyal kalsiyum analizi iskemi direncinin temelini ortaya eksitotoksik yaralanmalara ve diğerinin mekanizmaları önemli bir fikir temin edilen bir hangi EPMA uygulamaları.

Beyin hücreleri tipik olarak işemik koşulları altında ortaya çıkar ve patolojik sinir-iletici salıverilmesinde bir sonucu olarak eksitotoksik incinme. EPMA kalsiyum büyük miktarda ayırmak için nöronal mitokondri yeteneği yaralanma mekanizmasının temelini nasıl keşfetmek için kritik oldu. Şekil 3&#39;teki elektron mikrografı hızlı bir eksitotoksik uyarıcı (100 uM NMDA) ile 30 dakika maruz kaldıktan sonra dondurulabilir kültürlenmiş hipokampal nöronlar dondurularak kurutulmu?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar.

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Kemirgenler davranmak yılında Hareketli Silikon Problar tarafından Nöronlar Büyük ölçekli Kaydı

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Fare beynindeki Locus Coeruleus lokalizasyonu

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...