Name: calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons
Uploaded: 2013-11-12T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons at JoVE.com

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS065183 وأموال بدء من كلية روتجرز روبرت وود جونسون الطبية.

1. إعداد الجرذ نجمية الثقافة للإعلام مشروطة ونجمية الخلايا العصبية Cocultures. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تشريح العازلة (BSS، انظر الجدول 1 للصفة) وتخزينها في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران...

<ol>
	<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li><li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons.">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li><li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA.">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li><li>Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+cultured+neurons.">Transfecting cultured neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14,+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI(3,5)P(2)+and+PI(5)P.">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).</li><li>Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Hippocampal+Neurons+in+Low-Density+Culture.">Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+formation+of+a+DNA/calcium+phosphate+coprecipitate:+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons.">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li></ol>

وهناك العديد من المعايير الأساسية التي يجب أن تسيطر عليها بعناية لtransfections ناجحة على الدوام 10،11. المعلمة الأكثر أهمية بالنسبة لترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم هي قيمة الرقم الهيدروجيني لل2X HBS، والتي تختلف في أيدينا عادة ما بين 7،10-7،15. نوصي جعل ثلاث دفعات من الأسهم م...

الخلايا العصبية الأولية هي واحدة من أصعب أنواع الخلايا لبالنقل كما هي تالية للتفتل وحساسة جدا للتغيرات البيئية الصغرى. هناك أربعة أنواع شائعة الاستخدام من أساليب التعبير عن الجينات خارجية والرنا دبوس الشعر القصير (shRNAs) في هذه الخلايا 1. لكل منها مزاياه وعيوبه. على سبيل المثال، عادة ما يتم إجراء التثقيب الكهربائي في الخلايا العصبية معزولة طازجة 2، كما يجب أن يتم نقل الخلايا في cuvettes لترنسفكأيشن. يمكن أن عدوى فيروس عادة تحقيق كفاءة عالية جدا 3، ولكنه أكثر ومحفوفة بالمخاطر بالنسبة للمشغلين كثيفة العمالة. العديد من الكواشف ترنسفكأيشن بوساطة الدهون المتاحة تجاريا، بدرجات متفاوتة من النجاح في الخلايا العصبية ومستويات مختلفة من السمية الخلوية. ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يمثل طريقة مريحة واقتصادية لإدخال الجينات الغريبة إلى الخلايا العصبية. كان يستخدم الأسلوب الأول لإدخال الحمض النووي اتش سل في الثديياتليرة سورية من قبل غراهام وفان دير إب (1973) 4. تم إجراء ترنسفكأيشن عن طريق خلط كلوريد الكالسيوم مع الحمض النووي المؤتلف في العازلة الفوسفات. وهذا يسمح للتشكيل الفوسفات الحمض النووي / يترسب الكالسيوم والتي، عندما انخفض تدريجيا على أحادي الطبقة من الخلايا، والتمسك سطح الخلية، ويتم تناولها من قبل الإلتقام و اخيرا يدخل في النواة 5. ومن شأن هذه العملية تؤدي إلى التعبير عن الجينات الغريبة التي أدخلت في الخلية المستهدفة. الكفاءة نموذجية من مجموعة فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن بين 0،5-5٪ 6-8. ومع ذلك، مع الحرص على التحسين والتنفيذ المتسق للبروتوكول تجريبي، فمن الممكن للوصول إلى الكفاءة ترنسفكأيشن ما يقرب من 50٪. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون الأولية، التي cocultured مع الخلايا astroglial في شكل شطيرة 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14090-09</td>
			<td>straight / sharp 8.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Vannas-Tubinger spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15008-08</td>
			<td>angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Student surgical scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91401-14</td>
			<td>blunt / 14.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15006-09</td>
			<td>angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:207px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">14043-225-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">100 mM Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Glucose</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">1 M HEPES, pH 7.3</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>21130-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">DNase I</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Cytosine arabinoside</td>
			<td style="width:207px;">Calbiochem/EMD Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">251010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Kynurenic acid</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons

هطول فوسفات الكالسيوم هو وسيلة مريحة واقتصادية لترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة. مع التحسين، وأنه من الممكن استخدام هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب بالنقل مثل الخلايا العصبية الأولية. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون cocultured مع الخلايا astroglial.

عندما يتم تحسين المعلمات مختلفة من ترنسفكأيشن وبعناية للرقابة من تجربة إلى تجربة، فمن الممكن الحصول على الكفاءات ترنسفكأيشن تصل إلى 50٪. الشكل 1 يبين حقل من الخلايا العصبية التي يتم transfected مع GFP على DIV4. يحتوي على حقل ما مجموعه 28 الخلايا العصبية، ومنها و transfected 1...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons at JoVE.com

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

يعاير الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام مقايسة المذنب

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

مضان وتلألؤ بيولوجي التصوير من التحت خلوية كا<sup&gt; 2+</sup&gt; في المسنين الحصين الخلايا العصبية

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...