Name: calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons
Uploaded: 2013-11-12T18:30:00
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この作品は、NIHの助成金NS065183とラトガースロバートウッドジョンソンメディカルスクールからの起動の資金によってサポートされています。

1。馴化培地およびアストロサイトニューロン共培養ラットアストロサイト培養物を調製。 <ol><li> （BSSレシピについては表1を参照）解剖バッファを用意し、4℃で保存し、使用直前まで。 </li><li> 500ミリリットルのビーカー内のイソフルランで新生ラットの仔（P0-P2）を麻酔。 </li><li>子犬が動かないときは、70％エタノールでスプレーし、首を切る。 </li><li>脳を削除します。 <ol>...

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	<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li><li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons.">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li><li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA.">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li><li>Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+cultured+neurons.">Transfecting cultured neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14,+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI(3,5)P(2)+and+PI(5)P.">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).</li><li>Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Hippocampal+Neurons+in+Low-Density+Culture.">Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+formation+of+a+DNA/calcium+phosphate+coprecipitate:+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons.">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li></ol>

慎重に、一貫して成功したトランスフェクション10,11のために制御する必要があるいくつかの重要なパラメータがあります。リン酸カルシウムトランスフェクションのための最も重要なパラメータは、我々の手で、通常7.10から7.15の間で変化する2×HBS、pH値である。私たちは、pH計との違いを説明するために0.05刻みでpH値を有する株式の3つのバッチを作るお勧めします。別の方法とし?...

一次ニューロンは、それらが有糸分裂後で、微小環境の変化に非常に敏感であるようにトランスフェクトする最も困難な細胞タイプの一つである。これらの細胞1における外来遺伝子および短期ヘアピンRNA（shRNAの）の発現のための方法の4一般的に使用されるタイプがあります。それぞれ独自の長所と短所があります。細胞はトランスフェクションのためのキュベットに移しなければならないので、例えば、エレクトロポレーションは、通常、新たに単離されたニューロン2上で実行される。ウイルス感染は通常、非常に高い効率3を達成するが、事業者のためのより多くの労働集約的で危険であることができます。多くの脂質媒介トランスフェクション試薬は、ニューロンおよび細胞毒性の異なるレベルにおける成功の度合いは様々で、市販されている。 リン酸カルシウムトランスフェクションは、神経細胞に外来遺伝子を導入するための、便利で経済的な方法を表す。方法は、第一の哺乳類セルへのアデノウイルスDNAを導入するために使用されたグラハムとファンデEB（1973）によるLS 4。トランスフェクションは、リン酸緩衝液中の組換えDNAと塩化カルシウムを混合することにより行った。これは、徐々に細胞の単層上に滴下したとき、細胞表面に付着し、DNA /リン酸カルシウム沈殿物の形成は、エンドサイトーシスによって取り込まれることができ、最終的に核に5を入力してください。このプロセスは、標的細胞における導入外来遺伝子の発現につながる。 0.5〜5％、6〜8の間のリン酸カルシウムトランスフェクション範囲の典型的な効率。しかしながら、慎重な最適化お​​よび実験プロトコルの一貫性のある実行と、それは約50％のトランスフェクション効率を達成することができる。ここでは、サンドイッチフォーマット9にアストログリア細胞と共培養された初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション、私たちの詳細なプロトコルを記述します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14090-09</td>
			<td>straight / sharp 8.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Vannas-Tubinger spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15008-08</td>
			<td>angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Student surgical scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91401-14</td>
			<td>blunt / 14.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15006-09</td>
			<td>angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:207px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">14043-225-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">100 mM Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Glucose</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">1 M HEPES, pH 7.3</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>21130-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">DNase I</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Cytosine arabinoside</td>
			<td style="width:207px;">Calbiochem/EMD Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">251010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Kynurenic acid</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons

リン酸カルシウム沈殿法は、培養細胞のトランスフェクションのため便利で経済的な方法である。最適化により、一次ニューロンのような困難なトランスフェ細胞上で、この方法を使用することが可能である。ここでは、アストログリア細胞と共培養した海馬神経細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションのための私達の詳細なプロトコルを記述します。

トランスフェクションの異なるパラメータを最適化し、注意深く実験毎に制御される場合には、50％までのトランスフェクション効率を得ることができる。 図1は DIV4でGFPでトランスフェクトされたニューロンのフィールドを示している。フィールドが16をトランスフェクトした、そのうち28ニューロンの合計が含まれています。これは、50％以上の効率を表しています。同じカバ?...

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Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

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Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

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Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

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Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

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