Name: calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons
Uploaded: 2013-11-12T18:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH bidrag NS065183 och startmedel från Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.

1. Förbereda Råtta Astrocyte Kultur för konditionerat media och Astrocyte-neuron samodlingarna. <ol><li> Förbered dissektion buffert (BSS, se tabell 1 för receptet) och förvara vid 4 ° C tills produkten ska användas. </li><li> Bedöva neonatala råttungar (P0-P2) med isofluran i en 500 ml bägare. </li><li> När valparna är orörliga, spraya med 70% etanol och halshugga. </li><li> Ta bort hjärnan. <ol><li> Håll huvudet stadigt med ett par Dumont # 5 pincett, och använda fina sax för att g...

<ol>
	<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li><li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons.">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li><li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA.">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li><li>Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+cultured+neurons.">Transfecting cultured neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14,+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI(3,5)P(2)+and+PI(5)P.">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).</li><li>Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Hippocampal+Neurons+in+Low-Density+Culture.">Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+formation+of+a+DNA/calcium+phosphate+coprecipitate:+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons.">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li></ol>

Det finns flera viktiga parametrar som måste kontrolleras noggrant för konsekvent framgångsrika transfektioner 10,11. Den mest kritiska parametern för kalciumfosfat-transfektion är det pH-värde av 2x HBS, som i våra händer vanligen varierar mellan 7,10 till 7,15. Vi rekommenderar att tre partier av lager med pH-värden i 0.05 steg till svars för skillnaden mellan pH-mätare. Alternativt tillhandahåller Clontech däggdjurs transfektionskit 2x HBS som konsekvent ger god effektivitet. Tänk på att pH-...

Primära nervceller är en av de svåraste celltyper för transfektion eftersom de är postmitotisk och är mycket känsliga för mikromiljöförändringar. Det finns fyra allmänt använda typer av metoder för expression av exogena gener och de korta hårnåls RNAs (shRNAs) i dessa celler 1. Var och en har sina egna fördelar och nackdelar. Till exempel är elektroporation vanligen utförs på nyisolerade neuroner 2, som celler måste överföras till kyvetter för transfektion. Virusinfektion kan oftast uppnå mycket hög verkningsgrad 3, men är mer arbetskrävande och riskabelt för operatörerna. Många lipid-medierad transfektion reagens är kommersiellt tillgängliga, med varierande grader av framgång i neuroner och olika nivåer av cytotoxicitet. Kalciumfosfat transfektion representerar ett bekvämt och ekonomiskt sätt för att införa främmande gener i neuroner. Metoden användes först för att introducera adenovirus DNA i däggdjurs cells av Graham och van der Eb (1973) 4. Transfektion utfördes genom blandning av kalciumklorid med rekombinant-DNA i en fosfatbuffert. Detta möjliggör bildandet av DNA / kalciumfosfat utfällningar som när så småningom släpps på ett monolager av celler, hålla sig till cellytan, tas upp genom endocytos och slutligen in i kärnan 5. Denna process kommer att leda till expression av införda främmande gener i målcellen. Typiska effektivitetsvinsterna av kalciumfosfattransfektion intervall mellan 0,5-5% 6-8. Men med noggrann optimering och konsekvent genomförande av det experimentella protokollet, är det möjligt att nå en transfektionseffektivitet på nästan 50%. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av primära hippocampus nervceller, vilka samodlades med astrogliaceller i en sandwich-format 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14090-09</td>
			<td>straight / sharp 8.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Vannas-Tubinger spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15008-08</td>
			<td>angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Student surgical scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91401-14</td>
			<td>blunt / 14.5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:207px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15006-09</td>
			<td>angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:207px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">14043-225-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">100 mM Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Glucose</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">1 M HEPES, pH 7.3</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>21130-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">2.5% Trypsin</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">DNase I</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Cytosine arabinoside</td>
			<td style="width:207px;">Calbiochem/EMD Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">251010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Kynurenic acid</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons

Kalciumfosfatutfällning är en praktisk och ekonomisk metod för transfektion av odlade celler. Med optimering, är det möjligt att använda denna metod på svår transfektera celler som primära neuroner. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av hippocampus nervceller samodlades med astrogliaceller.

När de olika parametrarna för transfektion är optimerad, och kontrolleras noggrant från experiment till experiment, är det möjligt att erhålla transfektion effektivitet på upp till 50%. Figur 1 visar ett fält av neuroner som transfekteras med GFP på DIV4. Fältet innehåller totalt 28 neuroner, bland vilka 16 transfekterades. Detta motsvarar en verkningsgrad på över 50%. En sampling av andra områden på samma täckglas visar den totala effektiviteten är ca 50% (data ej visade). Med astrogl...

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons at JoVE.com

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering och kultur hippocampusneuroner från Prenatal möss

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analys DNA-skador i hippocampus neuroner Använda Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nervceller

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-density Primary hippocampus Neuron kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos i odlade nervceller i hippocampus

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...