Name: rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

سيكون الكتاب أود أن أشكر أعضاء في الماضي والحاضر في مختبرات الدكاترة. بيتر باليس وأدولفو غارسيا ساستري، لتطوير NDV عكس تقنيات الوراثة والمساعدة التقنية. ويتم تمويل البحوث في نيوكاسل فيروس المرض في AG-S المختبر جزئيا NIAD منح R01AI088770 وعن دائرة مركز الأمن الوطني للعلوم والتكنولوجيا التميز للالناشئة والأمراض الحيوانية المنشأ الحيواني (CEEZAD، الجائزة رقم 2010-ST-061-AG001). ويتم تمويل البحوث في LM-S المختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1 AI077719، R21NS075611-01، R03AI099681-01A1، ومراكز المعدية التميز لأبحاث الأنفلونزا والمراقبة (HHSN266200700008C)، وجامعة روتشستر المركز عن الدفاع البيولوجي المناعي النمذجة (HHSN272201000055C) .

1. إعداد خلايا الثدييات (الشكل 4A، يوم 1) تقسيم التهاب الكبد-2 أو A549 الخلايا قبل يوم واحد ترنسفكأيشن في 6 لوحات جيدة. كثافة الخلايا ينبغي أن تصل إلى 80-90٪ التقاء في اليوم التالي. عادة، يمكن تقسيم متموجة 100 مم طبق في 8 آبار (حوالي 1 × 10 6...

<ol>
	<li>Lamb, R. A., Parks, G. D., Howley, P. H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2007).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li><li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA:+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence.">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li><li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA.">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li><li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector.">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li><li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy:+old+challenges+and+new+directions.">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li><li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction.">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li><li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV)-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V,+W,+and+C+proteins.">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li><li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses.">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li><li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus.">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li><li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease.">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li><li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity:+avian+influenza+and+Newcastle+disease.">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li><li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses.">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies.">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li><li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus,+a+host+range-restricted+virus,+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens.">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li><li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector.">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li><li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans.">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus.">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li><li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function.">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li><li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein.">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li><li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+alpha/beta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses.">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li><li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha/beta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling.">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li><li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus.">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li><li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+(ORF)+3b,+ORF+6,+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists.">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li><li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes.">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li><li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+alpha/beta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels.">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li><li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response.">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li><li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense.">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li><li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA.">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li><li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector:+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication.">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li><li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rule+of+six,+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA.">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li><li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells.">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review.+New+mammalian+expression+vectors.">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li><li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+of+mononegavirales.">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li></ol>

العديد من العوامل التي يتعين النظر فيها لتحقيق نتائج جيدة في حين إنقاذ NDV. أولا، كدنا] بناء كامل طول لاستخدامها يحتاج إلى أن تكون مصممة للسماح إدماج وظيفية من الجينات المحورة الجديدة / التعديلات في جينوم فيروس النيوكاسل. وهذا يعني، كما ذكر أعلاه، أن (ط) نهاية المناسبة ?...

نيوكاسل فيروس المرض (NDV)، والفيروسة المخاطانية الطيور تنتمي إلى جنس Avulavirus 1، هو وكيل الحيوانية ذات الصلة من الناحية الاقتصادية، وبالتالي بحثها على نطاق واسع وsurveilled، والتي يمكن أن تؤثر بشدة على تربية الدواجن في جميع أنحاء العالم. وإن لم يكن العامل الممرض الإنسان، NDV كما تم دراسة وافية وراء المجال البيطري على حد سواء باعتبارها نموذجا الفيروسة المخاطانية ونظرا لاهتمام للغاية، والخصائص الطبيعية حال الورم 6. البحث عن NDV استفادت كثيرا من تطوير تقنيات الوراثة العكسية لاحد الذين تقطعت بهم السبل، غير مجزأة فيروسات RNA-بالمعنى السلبي، وصف لأول مرة لفيروس داء الكلب من قبل Conzelmann وcoleagues 2. مجموعة متنوعة من NDVs المعدلة وراثيا، التي تحمل الجينات أو تعديلات على النوع البري الجينوم الأجنبية وقد درس على نطاق واسع منذ ذلك الحين. العمل مع هذه الفيروسات المؤتلف كانت حاسمة لتوصيف عوامل الفوعة مختلفة ليس فقط من NDV ولكن أيضا من هوما الأخرى ذات الصلةن مسببات الأمراض مثل فيروس الانفلونزا 7 - أو الناشئة نيباه فيروس 8. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من الدراسات المختلفة قد استكشفت استخدام هذه التقنيات لتحسين النشاط antitumoral الفطرية NDV 6،9،10، معظمها من خلال تعزيز خصائص مناعة من الفيروس. وكانت منطقة أخرى ذات الصلة من البحوث حول NDVs المؤتلف الجيل المرشحين لقاح ضد الأمراض الفيروسية الأخرى مثل الأنفلونزا 5،11،12، 13 فيروس نقص المناعة البشرية، والحصبة 14، 15 السارس، أو أن يسببها فيروس sincytial التنفسي (RSV) 16. بين مختلف المزايا التي تقدمها يذكر NDV هي نقص المناعة الموجودة مسبقا في التجمعات البشرية، واستقرار إدراج الأجنبية الوراثية، وقلة النشاط recombinatory وعموما لمحة سلامة عالية جنبا إلى جنب مع خصائص مناعة الطبيعية المذكورة آنفا 17. ومن الجدير بالذكر أيضا إمكانية استخدام لقاحات الثنائي التكافؤ المؤتلف في عoultry والفيروسات واقية ضد كل من NDV وأنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض 11،12. وهذا قد يكون وسيلة ممتازة لتقليل فرص انتشار هذا الأخير من البرية للحيوانات المستأنسة، مما يساعد أيضا على منع ممكن قفزة أمور محددة من إنفلونزا الطيور إلى البشر اللعين. أخيرا، استخدمت NDV، معربا عن مراسل لتقييم الاستجابات المناعية الفطرية وكذلك تحديد مضاد للفيروسات مضاد الفيروسات المشفرة بواسطة عدة 18-27. عملية الانقاذ من المؤتلف، غير مجزأة، فيروس الحمض النووي الريبي السلبية تقطعت بهم السبل يتكون أساسا على إجبار مصطنع دورة تكاثر الفيروس في الخلايا المنتجة عليها بنقل كدنا] ترميز الحد الأدنى من الآلات الجزيئية المعدية، والمعروفة باسم بروتين نووي ريبوزي أو الأداء الملاحي المطلوب (الشكل 2). تتكون RNPs من بوليميريز الفيروسية (P و L البروتينات)، والبروتين النووي (NP) وكامل طول الحمض النووي الريبي antigenomic الفيروس. هذا الحمض النووي الريبي + antigenome هو القالب البريد اللازمة لجيل من الحمض النووي الريبي التكميلية-الجينوم، والتي، ويرتبط أيضا مع بقية البروتينات الفيروسية من الأداء الملاحي المطلوب، يلخص نفس المجمع المعدية أن الفيروس الطبيعية ستفرج عن سيتوبلازم الخلية على العدوى (الشكل 2A ). من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن للدورة الفيروسية المضي قدما بشكل طبيعي وvirions المؤتلف، encapsidating الجينوم تعديل، سيتم إنشاء (الشكل 2B). بشكل ملحوظ، ترنسفكأيشن من [كدنا] الجيني بدلا من [كدنا] antigenomic يضعف إلى حد كبير أو كليا تلغي الكفاءة الانقاذ 2،28-30. حتى عندما يتم transfected كدنا] antigenomic، كفاءة encapsidation من الحمض النووي الريبي المؤتلف في RNPs في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل هو على الارجح منخفضة للغاية. وبسبب هذا، بروتوكولات الانقاذ لNDV غالبا ما تشمل الخطوات المختلفة لالتضخيم من عدد قليل من الجسيمات الفيروسية التي صدرت من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل أصلا من قبل coculturing لهم خلايا متساهلة و / أو من قبلإصابة البيض المحتوي. قبل الإنقاذ، [كدنا] يمكن التلاعب بها من إجراءات الاستنساخ القياسية من أجل توليد التعديلات المرغوبة. بينما الطفرات محددة من المنتجات المختلفة وتسلسل الجينات التنظيمية للفيروس يمكن أن يتحقق بشكل مباشر بهذه الطريقة، فإن العديد من الأعمال المنشورة التي تنطوي المؤتلف NDV وقد تطلب إضافة وحدة جديدة النسخي في جينوم فيروس النيوكاسل. مثل أعضاء آخرين من عائلة الفيروسة المخاطانية، الجينوم NDV بترميز ثمانية بروتينات مختلفة في ست وحدات النسخي، والتي يتم التعبير عنها بشكل مختلف اعتمادا على الاحترام مواقعها إلى 3 &#39;نهاية التدرج في خفض الحرجة لدورة حياة الفيروسية 1. بسبب هذا، وموقع وحدة النسخي جديدة داخل الجينوم يجب اختيارها بعناية لتحقيق التوازن بين التعبير عن التحوير وضعف من تكاثر الفيروس. وقد استخدمت الإدراج بين P والجينات M أكثر، ركما تم اختبار مواقع أخرى هوغ 13،31. مهما كانت إدراج، استنساخ [كدنا] في NDV يحتاج إلى اتباع بعض القواعد لإنشاء بناء rescuable: (ط) أي الجينات الجديدة التي ستدرج في جينوم NDV يجب أن يكون تحت سيطرة الإشارات المناسبة لالفيروسي RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي البلمرة. يجب إضافة هذه المتتاليات المنبع من إطار القراءة المفتوح الجديد (ORF) حتى بوليميريز يمكن التعرف على نهاية الجين السابق (GE) وبداية جديدة التحوير (GS)، متباعدة من جانب واحد النوكليوتيدات تسلسل بين الجينات (IG) . ينصح بإضافة كوزاك صالح (K) تسلسل لتحسين ترجمة حقيقية النواة الريباسي أيضا لتحسين بروتين الأجنبية التعبير 32، (ب) النسخ المتماثل كفاءة NDV، كما لمعظم أعضاء الأسرة الفيروسات المخاطانية، تعتمد على طول الجينوم كونها متعددة من 33 ستة، وبالتالي، فإن أي الإدراج في NDV أن يتبع هذا &quot;حكم ستة&quot;. إذا لزم الأمر، مساالنيوكليوتيدات إضافية uired يمكن أن تضاف إلى المصب ORF جديدة، و (ج) يجب فحص تسلسل التحوير للعثور ممكن GE وGS مثل متواليات التي يمكن أن تضعف كفاءة الإنقاذ، والتعبير التحوير و / أو بقاء الفيروس. إذا كان موجودا، ويجب إزالة هذه تسلسلات الطفرات الصامتة. توليد المؤتلف طول كامل [كدنا] التالية القواعد المذكورة أعلاه هي الخطوة الأولى من أجل إنتاج بكفاءة NDV المعدلة وراثيا كما هو مفصل هنا. في النظام جميع بنيات الحمض النووي هي تحت سيطرة الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 المروج (الشكل 3). يتم توفير هذه البلمرة حشوية في العابرة عن طريق عدوى مرافقة مع المؤتلف تعديل اللقاحية أنقرة فيروس (MVA-T7) 34. إظهار الشكل 3A البلازميد pNDV-B1، التي بترميز كامل طول كدنا] antigenomic 5. يبين الشكل 3B البلازميدات pTM1 ترميز NP، P و L ORFS. البلازميدات pCITE-GFP، الذي يشفر، شالتانجو المروج T7، وبروتين الفلورية الخضراء (GFP)، وpCAGGs GFP 18، الذي يشفر نفس ORF تحت المروج الدجاج بيتا أكتين 35، وتستخدم والضوابط. في هذا البروتوكول نقدم لك مجموعة من الإجراءات لإنقاذ المؤتلف NDV من [كدنا] من lentogenic NDV سلالة Hitchner B1 5 (الشكل 4).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

نيوكاسل فيروس المرض (NDV)، عضو النموذج الأولي للجنس Avulavirus من عائلة الفيروسات المخاطانية 1، هو غير مجزأة، السلبية، بمعنى، واحد الذين تقطعت بهم السبل، ويلفها فيروس الحمض النووي الريبي (الشكل 1) مع التطبيقات المحتملة كناقل للتطعيم و علاج الأمراض التي تصيب الإنسان. أصبح في عمق استكشاف هذه التطبيقات ممكنا إلا بعد إنشاء الوراثة تقنيات العكسي لانقاذ الفيروسات المؤتلف من البلازميدات ترميز الجينوم الخاصة بهم على أكمل وجه [كدنا] 2-5. [كدنا] الفيروسية يمكن تعديلها بسهولة في المختبر باستخدام إجراءات الاستنساخ القياسية لتغيير التركيب الوراثي للفيروس و / أو لتشمل وحدات جديدة النسخي. إنقاذ مثل هذه الفيروسات المعدلة وراثيا يوفر أداة قيمة لفهم العوامل التي تؤثر على مراحل متعددة من العدوى، وكذلك يسمح لتطوير وتحسين ناقلات للتعبير وإيصال المستضداتللتطعيم والعلاج. نحن هنا وصف بروتوكول لإنقاذ NDVs المؤتلف.

إنقاذ NDV هو إجراء راسخة، يقوم بشكل روتيني في المختبرات التي يمكنها الوصول إلى كدنا] كاملة من الفيروس. ومع ذلك، فإن الطبيعة العشوائية لا يتجزأ من أسلوب يجعل من الصعب تحقيق الكفاءة الإنقاذ 100٪. رصد خطوات مبكرة من العملية، خصيصا كفاءة ترنسفكأيشن والعدوى مع MVA-T7، ويساعد عل...

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

نيوكاسل فيروس المرض (NDV) وقد درس على نطاق واسع في السنوات القليلة الماضية من أجل تطوير ناقلات جديدة للتطعيم والعلاج وغيرها. وكانت هذه الدراسات ممكن نظرا لتقنيات لانقاذ الفيروس المؤتلف من [كدنا]، مثل تلك التي وصفنا هنا.

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...