Name: rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

מחברים מבקשים להודות לחברים בעבר ובהווה במעבדות של בני הזוג. פיטר Palese ואדולפו גרסיה ססטרה לפיתוח NDV הפוך טכניקות גנטיקה ולסיוע טכני. מחקר בנגיף מחלת ניוקאסל במעבדה AG-S ממומן חלקית על ידי NIAD להעניק R01AI088770 ועל ידי המחלקה לביטחון מולדת מרכז מדע וטכנולוגיה של אקסלנס למתעורר ומחלות zoonotic בעלי החיים (CEEZAD, מספר הפרס 2010-ST-061-AG001). מחקר במעבדה של LM-S ממומן על ידי מענקי NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, מרכזי NIAID למצוינות לחקר שפעת ומעקב (HHSN266200700008C), ואוניברסיטת רוצ&#39;סטר המרכז לBiodefense חיסון דוגמנות (HHSN272201000055C) .

1. הכנת תאי יונקים (איור 4A, יום 1) פיצול הפ-2 או A549 תאי היום לפני transfection ב6 גם צלחות. צפיפות של התאים צריכה להגיע למפגש 80-90% ביום שלמחרת. בדרך כלל, 100 מנה מ&quot;מ מחוברות ניתן לפצל 8 בארות (בסביבות 1 x 10 6 תאים לכל טוב). שליציל את כל וירוס, י...

<ol>
	<li>Lamb, R. A., Parks, G. D., Howley, P. H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2007).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li><li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA:+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence.">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li><li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA.">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li><li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector.">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li><li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy:+old+challenges+and+new+directions.">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li><li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction.">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li><li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV)-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V,+W,+and+C+proteins.">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li><li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses.">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li><li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus.">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li><li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease.">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li><li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity:+avian+influenza+and+Newcastle+disease.">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li><li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses.">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies.">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li><li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus,+a+host+range-restricted+virus,+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens.">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li><li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector.">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li><li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans.">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus.">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li><li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function.">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li><li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein.">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li><li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+alpha/beta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses.">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li><li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha/beta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling.">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li><li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus.">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li><li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+(ORF)+3b,+ORF+6,+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists.">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li><li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes.">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li><li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+alpha/beta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels.">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li><li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response.">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li><li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense.">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li><li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA.">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li><li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector:+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication.">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li><li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rule+of+six,+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA.">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li><li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells.">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review.+New+mammalian+expression+vectors.">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li><li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+of+mononegavirales.">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li></ol>

מספר גורמים שיש להתחשב על מנת להשיג תוצאות טובות בזמן הצלת NDV. ראשית, מבנה cDNA באורך מלא כדי לשמש צריך להיות מתוכנן כדי לאפשר את השילוב הפונקציונלי של transgenes / השינויים החדשים לתוך הגנום NDV. משמעות דבר היא, כאמור לעיל, שרצפי הסוף (i) מתאים גנטית (GE), intergenic (IG) ותחילת גן (GS) הם ש?...

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), paramyxovirus עופות המשתייכים לסוג Avulavirus 1, הוא סוכן zoonotic כלכלי רלוונטי ובכך נחקר באופן נרחב ומעקבים, אשר באופן חמור יכול להשפיע על גידול עופות בכל רחבי העולם. למרות שלא הפתוגן אנושי, NDV גם נחקר ביסודיות מעבר לשדה הווטרינר הן כparamyxovirus מודל ובשל המאפיינים שלה מעניינים מאוד, הטבעיים oncolytic 6. מחקר על NDV תועלת רב מהפיתוח של טכניקות גנטיקה הפוכה לוירוסים חד גדילים, שאינם מפולחים תחושה השלילית RNA, שתוארו לראשונה על ידי וירוס כלבת Conzelmann וcoleagues 2. מגוון של NDVs מהונדס גנטי, שנשא גנים או שינויים של הגנום הסוג הבר זרים נחקרו בהרחבה מאז. עבודה עם וירוסי רקומביננטי אלה הייתה קריטית כדי לאפיין גורמים ארסי שונים, לא רק של NDV אלא גם של הומא הרלוונטי האחרn פתוגנים כמו שפעת 7 וירוס - וירוס Nipah או מתהווה 8. יתר על כן, מספר מחקרים שונים בחנו את השימוש בטכניקות הללו כדי לשפר את פעילות antitumoral המולדת של NDV 6,9,10, בעיקר על ידי שיפור מאפייני immunostimulatory של הנגיף. אזור רלוונטי אחר של מחקר על NDVs רקומביננטי היה הדור של מועמדי חיסון נגד מחלות ויראליות אחרות כמו שפעת 5,11,12, 13 איידס, חצבת 14, 15 סארס, או שנגרם על ידי נגיף sincytial הנשימה (RSV) 16. בין היתרונות הבולטים השונים הניתנים על ידי NDV הם חוסר החסינות קיימת מראש באוכלוסיות אנושיות, היציבות מוסיף חוץ גנטי, חוסר פעילות recombinatory וכולל פרופיל בטיחות גבוה בשילוב עם מאפייני immunostimulatory הטבעיים האמורים 17. זה גם ראוי לציון השימוש הפוטנציאלי של חיסונים דו ערכי רקומביננטי בעמ &#39;oultry, שפעת עופות מגנה מפני שני NDV ופתוגניים מאוד וירוסי 11,12. זו עשויה להיות דרך מצוינת כדי להפחית את הסיכויים של האחרון מתפשטים מטבע לבעלי חיים מבויתים, ובכך גם עוזרים למנוע קפיצת היתר ספציפית אפשרית של שפעת עופות חשש לבני אדם. לבסוף, NDV-להביע כתב היה בשימוש להערכה של תגובות חיסוניים מולדים, כמו גם זיהוי של אנטגוניסט אינטרפרון המקודד על ידי וירוסים מרובים 18-27. תהליך ההצלה של רקומביננטי, שאינו מפולח, נגיף RNA שלילי תקוע בעצם מורכב באופן מלאכותי מאלץ את מחזור שכפול נגיפי בתא ייצור על ידי transfecting קידוד cDNA המכונות מינימליות התולעת מולקולרית, המכונים ribonucleoprotein או RNP (איור 2). RNPs מורכב של פולימראז הנגיפי (P וחלבונים L), nucleoprotein (NP) ורנ&quot;א antigenomic באורך המלא של הנגיף. RNA + antigenome זו הוא התבנית דואר הנדרשת עבור הדור של RNA-הגנום המשלים, אשר, קשור גם עם שאר החלבונים של RNP הנגיפי, משחזרת את אותו מורכב מדבק שנגיף טבעי ישחרר בציטופלסמה של התא על זיהום (איור 2A ). משלב זה ואילך, המחזור הנגיפי יכול להמשיך באופן טבעי וויריונים רקומביננטי, encapsidating גנומים שונה, יופקו (איור 2). למרבה הפלא, transfection של cDNA גנומי במקום cDNA antigenomic מאוד פוגע או לחלוטין מבטל את יעילות הצלת 2,28-30. גם כאשר cDNA antigenomic הוא transfected, את היעילות של encapsidation של RNA רקומביננטי לRNPs בתאי transfected היא כנראה נמוכה מאוד. בגלל זה, פרוטוקולי הצלה לNDV לעתים קרובות כוללים צעדים שונים להגברה של כמה חלקיקים נגיפיים שוחררו מתאי transfected במקור על ידי coculturing אותם עם תאים מתירנית ו / או על ידיזיהום של ביצי embryonated. לפני ההצלה, ניתן להשפיע cDNA על ידי נהלי שיבוט סטנדרטיים על מנת ליצור את השינויים הרצויים. בעוד מוטציות ספציפיות של מוצרי גן השונים ורצפים רגולטוריים של הנגיף יכולות להיות מושגת בדרך זו בצורה ישירה, רבים של העבודה שפורסמה מעורבת NDV רקומביננטי דרש תוספת של יחידת תעתיק חדשה לתוך הגנום NDV. כמו חברים אחרים במשפחת paramyxovirus, הגנום מקודד NDV שמונה חלבונים שונים לשש יחידות תעתיק, אשר באות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בהתאם למיקום שלהם ביחס לסוף &#39;3 ​​בשיפוע יורד קריטי עבור מחזור החיים הנגיפי 1. בגלל זה, את המיקום של יחידת תעתיק החדשה בתוך הגנום חייב להיות שנבחר בקפידה כדי להשיג איזון בין הביטוי של transgene וירידת הערך של שכפול נגיפי. הכנסה בין P וגני M כבר בשימוש, לא הכיאתרים אחרים האף גם נבדקו 13,31. לא משנה מה להוסיף, השיבוט לNDV cDNA צריך לעקוב אחר כמה כללים כדי ליצור מבנה rescuable: (i) כל גן חדש שייכלל לתוך הגנום NDV צריך להיות תחת שליטה של ​​האותות המתאימים לRNA תלוי-RNA הנגיפי פולימראז. רצפים אלה יש להוסיף במעלה הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה החדשה (ORF) כך פולימראז יכול לזהות את הסוף של הגן הקודם (GE) ותחילתו של transgene החדש (GS), במרווחים של רצף intergenic נוקלאוטיד יחיד (IG) . תוספת של קוזאק תקף (K) רצף כדי לשפר את תרגום ריבוזומלי אוקריוטים מומלץ גם לחלבון זר ביטוי טוב יותר 32 (ii) שכפול יעיל של NDV, כמו עבור רוב בני משפחת Paramyxoviridae, תלוי באורך הגנום להיות מרובה של שש 33, ולכן כל כניסה לתוך NDV יש לעקוב &quot;השלטון של שש&quot; הזה. במידת צורך, reqניתן להוסיף נוקלאוטידים נוספים uired מורד הזרם ORF החדש, וכן (iii) את הרצף של transgene צריך להיבדק כדי למצוא אפשרי GE ו GS כמו רצפים אשר עלול לפגוע ביעילות הצלה, ביטוי transgene ו / או כדאיות וירוס. אם קיימים, רצפים אלה יש להסיר על ידי mutagenesis השקט. הדור של cDNA באורך המלא רקומביננטי הבא כללים הנ&quot;ל הוא הצעד הראשון כדי לייצר ביעילות NDV מהונדס גנטי כמפורט כאן. במערכת כל בונה DNA נמצא תחת שליטה של אמרגן פולימראז T7-RNA (איור 3). פולימראז cytoplasmic זה מסופק בטרנס ידי coinfection עם vaccinia וירוס אנקרה הותאם רקומביננטי (MVA-T7) 34. איור 3 א מציג את פלסמיד pNDV-B1, אשר מקודד cDNA antigenomic באורך מלא 5. איור 3 ב מציג פלסמידים pTM1 קידוד NP, ORFs P ו-L. פלסמידים pCITE-GFP, אשר מקודד, under אמרגן T7, החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP), וpCAGGS GFP 18, אשר מקודד באותו ORF תחת האמרגן אקטין בטא עוף 35, משמשים כקבוצת ביקורת. בפרוטוקול זה אנו מציגים את ההליך כדי להציל NDV רקומביננטי מcDNA של B1 lentogenic NDV Hitchner זן 5 (איור 4).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), חבר אב הטיפוס של סוג Avulavirus של המשפחה 1 Paramyxoviridae, הוא שאינם מפולח תחושה שלילית,, חד גדילים, עטף וירוס RNA (איור 1) עם יישומים פוטנציאליים כוקטור לחיסון ו טיפול במחלות אנושיות. חקירה לעומק של יישומים אלה הפכה להיות אפשרית רק לאחר הקמתה של טכניקות גנטיקה הפוכה כדי להציל וירוסי רקומביננטי מפלסמידים קידוד הגנום המלא שלהם כcDNA 2-5. cDNA הנגיפי יכול להיות שונה בנוחות במבחנה באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים לשנות את גנוטיפ של הווירוס ו / או לכלול יחידות תעתיק חדשות. הצלה של וירוסים מהונדסים גנטי כזה מספקת כלי רב ערך כדי להבין את הגורמים המשפיעים על שלבים רבים של זיהום, כמו גם מאפשר פיתוח והשיפור של וקטורים לביטוי והאספקה ​​של אנטיגניםלחיסון וטיפול. כאן אנו מתארים פרוטוקול להצלת NDVs רקומביננטי.

הצלה של NDV היא הליך מבוסס היטב, מבוצע באופן שיגרתי במעבדות שיש להם גישה לcDNA של הנגיף השלם. עם זאת, הטבע סטוכסטיים המהותי של השיטה הופך אותו לקשה להשגה 100% יעילות הצלה. ניטור השלבים המוקדמים של התהליך, במיוחד את יעילות transfection והזיהום עם MVA-T7, מסייע בזיהוי בעיות אפשריות. <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...