Name: rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

लेखक डीआरएस की प्रयोगशालाओं में अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. पीटर Palese और NDV के विकास के लिए Adolfo गार्सिया-Sastre आनुवांशिकी तकनीक और तकनीकी सहायता के लिए रिवर्स. NIAD R01AI088770 अनुदान और उत्कृष्टता के होमलैंड सुरक्षा विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र के विभाग द्वारा लिए द्वारा एजी-प्रयोगशाला में न्यूकासल रोग वायरस में रिसर्च आंशिक रूप से वित्त पोषित है उभरते और जूनोटिक पशु रोग (CEEZAD, पुरस्कार संख्या 2010-ST-061-AG001). एल एम एस प्रयोगशाला में रिसर्च एनआईएच अनुदान RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, इन्फ्लुएंजा अनुसंधान और निगरानी (HHSN266200700008C) के लिए उत्कृष्टता के NIAID केंद्र, और biodefense इम्यून मॉडलिंग के लिए रोचेस्टर सेंटर के विश्वविद्यालय (HHSN272201000055C) द्वारा वित्त पोषित है .

1. स्तनधारी कोशिकाओं की तैयारी (चित्रा -4 ए, दिन 1) स्प्लिट एचईपी-2 या A549 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटें में अभिकर्मक से पहले दिन. कोशिकाओं के घनत्व अगले दिन 80-90% संगम तक पहुंच जाना चाहिए. आमतौर पर, एक मिल?...

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	<li>Lamb, R. A., Parks, G. D., Howley, P. H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2007).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li><li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. 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कई कारकों NDV बचाव करते हुए अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना है. सबसे पहले, प्रयोग की जाने वाली पूर्ण लंबाई सीडीएनए निर्माण NDV जीनोम में नए transgenes / संशोधनों के कार्यात्मक समावेश अनुमति देने क...

न्यूकासल रोग वायरस (NDV), Avulavirus जीनस 1 से संबंधित एक एवियन paramyxovirus, गंभीर रूप से दुनिया भर के सभी पोल्ट्री खेती को प्रभावित कर सकते हैं जो एक आर्थिक रूप से प्रासंगिक और इस तरह व्यापक रूप से शोध और surveilled जूनोटिक एजेंट है. नहीं एक मानव रोगज़नक़ हालांकि, NDV भी अच्छी तरह से एक मॉडल paramyxovirus के रूप में और इसकी वजह से बेहद रोचक, प्राकृतिक oncolytic गुणों से 6 दोनों पशुचिकित्सा क्षेत्र से परे अध्ययन किया गया है. NDV पर अनुसंधान बहुत पहले CONZELMANN और coleagues 2 से रेबीज वायरस के लिए वर्णित एकल असहाय, गैर खंडों नकारात्मक भावना आरएनए वायरस, के लिए रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक के विकास से लाभ हुआ. विदेशी जीन या उनके जंगली प्रकार जीनोम के संशोधनों को ले जाने आनुवंशिक रूप से संशोधित NDVs, की एक किस्म व्यापक रूप से कभी के बाद से अध्ययन किया गया है. इन पुनः संयोजक वायरस के साथ काम NDV की बल्कि अन्य प्रासंगिक हुमा की न केवल अलग विषैलापन कारकों को चिह्नित करने के लिए आलोचना की गई हैn इस तरह इन्फ्लूएंजा ए वायरस के रूप में 7 रोगजनकों - या आकस्मिक Nipah वायरस 8. इसके अलावा, विभिन्न अध्ययनों के एक नंबर ज्यादातर वायरस के immunostimulatory गुणों को बढ़ाने के द्वारा, NDV 6,9,10 की जन्मजात antitumoral गतिविधि में सुधार के लिए इन तकनीकों के प्रयोग का पता लगाया है. पुनः संयोजक NDVs पर अनुसंधान के अन्य प्रासंगिक क्षेत्र इन्फ्लूएंजा 5,11,12 के रूप में अन्य वायरल बीमारियों के खिलाफ टीका उम्मीदवारों की पीढ़ी कर दिया गया है, एचआईवी 13, सार्स 15, 14 खसरा, या कि श्वसन sincytial वायरस (आरएसवी) 16 की वजह से. NDV द्वारा प्रदान की विभिन्न उल्लेखनीय फायदे मानव आबादी में प्रतिरक्षा preexisting की कमी कर रहे हैं के बीच, विदेशी आनुवंशिक सम्मिलित करता है, recombinatory गतिविधि की कमी और समग्र aforementioned प्राकृतिक immunostimulatory गुण 17 के साथ संयुक्त एक उच्च सुरक्षा प्रोफाइल की स्थिरता. यह भी पी में पुनः संयोजक बीवालेन्त टीके की क्षमता का उपयोग उल्लेखनीय हैoultry, NDV दोनों के खिलाफ रक्षात्मक और उच्च रोगजनक एवियन इन्फ्लूएंजा 11,12 वायरस. इस प्रकार भी मनुष्य के लिए खतरनाक बर्ड फ्लू के संभावित अंतर - विशिष्ट कूद को रोकने में मदद, पालतू जानवरों के लिए जंगली से फैल बाद के अवसरों को कम करने के लिए एक शानदार तरीका हो सकता है. अंत में, रिपोर्टर व्यक्त NDV सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के साथ ही कई वायरस 18-27 द्वारा इनकोडिंग इंटरफेरॉन प्रतिपक्षी की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक पुनः संयोजक का बचाव प्रक्रिया, गैर खंडों, नकारात्मक असहाय आरएनए वायरस मूल रूप से कृत्रिम रूप से Ribonucleoprotein या RNP के रूप में जाना न्यूनतम संक्रामक आणविक मशीनरी, चित्रा (2) एन्कोडिंग सीडीएनए transfecting द्वारा एक उत्पादक सेल में एक वायरल प्रतिकृति चक्र मजबूर पर होते हैं. RNPs वायरल पोलीमर्स (पी और एल प्रोटीन) से मिलकर बनता है, nucleoprotein (एनपी) और वायरस के पूर्ण लंबाई antigenomic आरएनए. इस शाही सेना + antigenome वें हैभी वायरल RNP के प्रोटीन के आराम के साथ जुड़ा हुआ है, जो पूरक आरएनए जीनोम की पीढ़ी के लिए आवश्यक ई टेम्पलेट, एक प्राकृतिक वायरस संक्रमण पर सेल के cytoplasm (चित्रा 2A पर रिलीज होगी कि एक ही संक्रामक जटिल स्मरण दिलाता है ). बाद में इस कदम से, वायरल चक्र स्वाभाविक रूप से आगे बढ़ सकते हैं और संशोधित जीनोम encapsidating पुनः संयोजक virions, चित्रा (2 बी) उत्पन्न हो जाएगा. उल्लेखनीय है, बजाय antigenomic सीडीएनए के जीनोमिक सीडीएनए के अभिकर्मक बहुत impairs या पूरी तरह से बचाव दक्षता 2,28-30 समाप्त करता है. Antigenomic सीडीएनए ट्रांसफ़ेक्ट है, तब भी जब कोशिकाओं में RNPs में पुनः संयोजक शाही सेना के encapsidation की दक्षता शायद बहुत कम है. इस वजह से, NDV के लिए बचाव प्रोटोकॉल अक्सर अनुमोदक कोशिकाओं के साथ और / या द्वारा उन्हें coculturing द्वारा मूल रूप से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से जारी कुछ वायरल कणों के प्रवर्धन के लिए विभिन्न चरणों में शामिलembryonated अंडे का संक्रमण. पिछले बचाव के लिए, सीडीएनए वांछित संशोधनों उत्पन्न करने के क्रम में मानक क्लोनिंग प्रक्रियाओं द्वारा चालाकी से किया जा सकता है. विभिन्न जीन उत्पादों और वायरस के विनियामक दृश्यों के विशिष्ट परिवर्तन straightforwardly इस तरह से प्राप्त किया जा सकता है, पुनः संयोजक NDV शामिल प्रकाशित काम के कई NDV जीनोम में एक नया ट्रांसक्रिप्शनल इकाई के अलावा आवश्यकता है. Paramyxovirus परिवार के अन्य सदस्यों की तरह, NDV जीनोम विभिन्न वायरल जीवन चक्र 1 के लिए महत्वपूर्ण एक कम ढाल में 3 &#39;के अंत तक उनके स्थान सम्मान के आधार पर व्यक्त कर रहे हैं जो छह ट्रांसक्रिप्शनल इकाइयों में आठ विभिन्न प्रोटीन encodes. इस वजह से, जीनोम के भीतर नई ट्रांसक्रिप्शनल इकाई के स्थान को ध्यान से वायरल प्रतिकृति के transgene और हानि की अभिव्यक्ति के बीच एक संतुलन प्राप्त करने के लिए चुना जाना चाहिए. पी और एम जीन के बीच निवेशन सबसे, टी इस्तेमाल किया गया हैHough अन्य साइटों को भी 13,31 परीक्षण किया गया है. (मैं) NDV जीनोम में शामिल होने के लिए किसी भी नए जीन वायरल शाही सेना पर निर्भर शाही सेना के लिए उपयुक्त संकेतों के नियंत्रण के अधीन हो गया है: जो कुछ भी डालने, NDV सीडीएनए में क्लोनिंग एक rescuable निर्माण उत्पन्न करने के लिए कुछ नियमों का पालन करने की जरूरत है पोलीमर्स. इन दृश्यों नया खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) के अपस्ट्रीम में जोड़ा जाना चाहिए ताकि पोलीमर्स एक एकल nucleotide intergenic अनुक्रम (आईजी) से स्थान दिया गया है, जो पिछले जीन (जीई) और नई transgene (जी एस) की शुरुआत के अंत पहचान सकते हैं . Paramyxoviridae परिवार के अधिकांश सदस्यों के लिए के रूप में NDV (ii) कुशल प्रतिकृति, जीनोम लंबाई के कई किया जा रहा है पर निर्भर है, एक वैध कोज़ाक (कश्मीर) यूकेरियोटिक ribosomal अनुवाद में सुधार करने के अनुक्रम के अलावा भी बेहतर विदेशी प्रोटीन अभिव्यक्ति 32 के लिए सिफारिश की है छह 33, इसलिए NDV में किसी भी प्रविष्टि इस &quot;छह के नियम&quot; का पालन किया है. यदि आवश्यक हो, अनुरोधuired अतिरिक्त nucleotides बहाव के नए ओआरएफ जोड़ा जा सकता है, और (iii) transgene की अनुक्रम खोजने के लिए जाँच की जानी चाहिए संभव जीई और बचाव दक्षता, transgene अभिव्यक्ति और / या वायरस व्यवहार्यता प्रभावित हो सकती है, जो दृश्यों की तरह जी एस. अगर मौजूद है, इन दृश्यों चुप mutagenesis के द्वारा हटा दिया जाना चाहिए. aforementioned नियमों का पालन पुनः संयोजक पूरी लंबाई सीडीएनए की पीढ़ी कुशलता से यहाँ विस्तृत रूप में एक आनुवंशिक रूप से संशोधित NDV उत्पादन के क्रम में पहला कदम है. सिस्टम में सभी डीएनए निर्माणों T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर (चित्रा 3) के नियंत्रण में हैं. इस cytoplasmic पोलीमर्स एक पुनः संयोजक संशोधित चेचक अंकारा वायरस (एमवीए-T7) 34 के साथ coinfection द्वारा ट्रांस में प्रदान की जाती है. चित्रा 3A पूर्ण लंबाई antigenomic सीडीएनए 5 encodes जो pNDV-B1 प्लाज्मिड, दिखा. चित्रा 3B pTM1 plasmids एनपी एन्कोडिंग से पता चलता है, पी और एल ORFs. , यू encodes जो प्लास्मिड pCITE GFP,nder T7 प्रमोटर, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), और चिकन बीटा actin के प्रमोटर 35 के तहत एक ही ओआरएफ encodes जो pCAGGS GFP 18, नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में हम lentogenic NDV तनाव Hitchner बी 1 से 5 (चित्रा 4) के सीडीएनए से पुनः संयोजक NDV बचाव के लिए प्रक्रिया दिखा.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

न्यूकासल रोग वायरस (NDV), परिवार Paramyxoviridae 1 की Avulavirus जीनस का प्रोटोटाइप सदस्य, एक गैर खंडों, नकारात्मक भावना, एकल असहाय, टीकाकरण के लिए एक वेक्टर के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के साथ शाही सेना वायरस (चित्रा 1) छा और है मानव रोगों का इलाज. इन आवेदनों की गहराई अन्वेषण केवल सीडीएनए 2-5 के रूप में उनकी पूर्ण जीनोम एन्कोडिंग plasmids से पुनः संयोजक वायरस बचाव के लिए रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक की स्थापना के बाद संभव हो गया है. वायरल सीडीएनए सुविधा वायरस के जीनोटाइप को बदलने के लिए और / या नए ट्रांसक्रिप्शनल इकाइयों में शामिल करने के लिए मानक क्लोनिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करके इन विट्रो में संशोधित किया जा सकता है. ऐसे आनुवंशिक रूप से संशोधित वायरस से बचाव कारकों संक्रमण के कई चरणों को प्रभावित करने, और साथ ही एंटीजन की अभिव्यक्ति और वितरण के लिए वैक्टर के विकास और सुधार के लिए अनुमति देता है समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता हैटीकाकरण और उपचार के लिए. यहाँ हम पुनः संयोजक NDVs के बचाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

NDV का बचाव नियमित वायरस का पूरा सीडीएनए लिए उपयोग किया है कि प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन एक सुस्थापित प्रक्रिया है. हालांकि, विधि के आंतरिक स्टोकेस्टिक प्रकृति यह कठिन 100% बचाव दक्षता हासिल करने के लिए बन?...

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

न्यूकासल रोग वायरस (NDV) बड़े पैमाने पर अन्य लोगों के अलावा, टीकाकरण और उपचार के लिए नए वैक्टर विकसित करने के लिए पिछले कुछ वर्षों में अध्ययन किया गया है. इन अध्ययनों के कारण इस तरह हम यहाँ वर्णन उन के रूप में सीडीएनए से पुनः संयोजक वायरस बचाव के लिए तकनीक, संभव हो गया है.

सीडीएनए से संयोजक न्यूकासल रोग वायरस का बचाव

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

पुनः संयोजक इन्फ्लुएंजा वायरस के डीएनए प्लाज्मिड से पीढ़ी

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अग्रदूत बी सेल सबसेट के गर्भनाल रक्त से अलगाव

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The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

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संक्रमित Ifnar1 के Immunoprivileged अंगों में Zika वायरस-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन-चूहों/

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...