Name: rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

Författarna vill tacka tidigare och nuvarande medlemmar i laboratorier Dr. Peter Palese och Adolfo García-Sastre för utveckling av NDV omvänd genetik och för tekniskt stöd. Forskning i Newcastlevirus i AG-S laboratorium är delvis finansierat av NIAD bevilja R01AI088770 och av Department of Homeland Security Science &amp; Technology Center of Excellence för nya och Zoonotic djursjukdomar (CEEZAD, utmärkelse nummer 2010-ST-061-AG001). Forskning i LM-S laboratorium finansieras av NIH bidrag RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning (HHSN266200700008C), och The University of Rochester Centrum för Biodefense Immunmodeling (HHSN272201000055C) .

1. Framställning av däggdjursceller (Figur 4A, Dag 1) Sträck HEp-2 eller A549-celler dagen före transfektion i 6-brunnars plattor. Densitet av cellerna bör nå 80-90% sammanflödet följande dag. Vanligtvis kan ett sammanflytande 100 mm skål delas upp i åtta brunnar (omkring 1 x 10 6 celler per brunn). För varje virus som ska räddas, bör 2-4 olika brunnar tas med, samt 2 extra brunnar för kontrollerna pCAGGS-GFP och pCITE-GFP 18, i syfte att ö...

<ol>
	<li>Lamb, R. A., Parks, G. D., Howley, P. H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2007).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li><li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA:+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence.">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li><li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA.">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li><li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector.">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li><li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy:+old+challenges+and+new+directions.">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li><li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction.">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li><li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV)-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V,+W,+and+C+proteins.">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li><li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses.">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li><li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus.">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li><li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease.">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li><li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity:+avian+influenza+and+Newcastle+disease.">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li><li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses.">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies.">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li><li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus,+a+host+range-restricted+virus,+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens.">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li><li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector.">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li><li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans.">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus.">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li><li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function.">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li><li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein.">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li><li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+alpha/beta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses.">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li><li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha/beta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling.">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li><li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus.">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li><li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+(ORF)+3b,+ORF+6,+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists.">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li><li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes.">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li><li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+alpha/beta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels.">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li><li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response.">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li><li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense.">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li><li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA.">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li><li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector:+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication.">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li><li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rule+of+six,+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA.">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li><li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells.">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review.+New+mammalian+expression+vectors.">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li><li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+of+mononegavirales.">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li></ol>

Flera faktorer ska beaktas för att uppnå bra resultat samtidigt rädda NDV. Först den fullängds cDNA-konstruktion som ska användas måste utformas så att den funktionella införlivandet av nya transgener / ändringar i NDV genomet. Detta innebär, enligt ovan, att (i) lämplig gen end (GE), intergen (IG) och gen start (GS) sekvenser är att läggas till vid behov, (ii) det inte finns några förmodade GE eller GS-sekvenser i den utländska gen, och (iii) den fullständiga rekombinanta genomet följer den &quot;reg...

Newcastlevirus (NDV), en avian paramyxovirus tillhör Avulavirus släktet 1, är en ekonomiskt relevant och därmed allmänt forskat och övervakade zoonotiska smittämnet, som allvarligt kan påverka fjäderfäuppfödning runt om i världen. Även om inte en mänsklig patogen, NDV har också studerats ingående utanför veterinär området både som modell paramyxovirus och på grund av sin mycket intressanta, naturliga oncolytic egenskaper 6. Forskning om NDV stor nytta av utvecklingen av omvänd genetik för enkelsträngade, icke-segmenterade negativ-sense RNA-virus, först beskrivna för rabiesvirus från Conzelmann och coleagues 2. En mängd genetiskt modifierade NDVs, bär främmande gener eller modifieringar av deras vildtyp genomet har studerats sedan dess. Arbetet med dessa rekombinanta virus har varit avgörande för att karakterisera olika virulensfaktorer inte bara av NDV utan också av andra relevanta human patogener som influensa A-virus 7 - eller den framväxande nipahvirus 8. Dessutom har ett antal olika studier undersökte användningen av dessa tekniker för att förbättra den inneboende antitumöraktivitet av NDV 6,9,10, främst genom att öka den immunstimulerande egenskaper av viruset. Annan relevant område av forskning på rekombinanta NDVs har varit alstringen av vaccinkandidater mot andra virala sjukdomar såsom influensa 5,11,12, HIV 13 mässlings 14, SARS 15, eller den som orsakas av det respiratoriska sincytial virus (RSV) 16. Bland de olika anmärkningsvärda fördelar som NDV är bristen på redan existerande immunitet i befolkningsgrupper, stabiliteten i de utländska genetiska insatser, brist på recombinatory aktivitet och övergripande en hög säkerhetsprofil i kombination med de ovan nämnda naturliga immunstimulerande egenskaper 17. Det är också anmärkningsvärt att potentiella användningen av rekombinanta bivalenta vacciner i poultry, virus skydd mot både NDV och högpatogen aviär influensa 11,12. Detta kan vara ett utmärkt sätt att minska risken för de senare sprids från vilda till tama djur, vilket också bidrar till att förhindra en eventuell interspecifik hoppa av den fruktade fågelinfluensan för människor. Slutligen reporter uttrycker NDV har använts för utvärdering av medfödda immunsvar samt identifiering av interferon antagonist kodas av flera virus 18-27. Räddningsprocessen av en rekombinant, icke-segmenterade, negativ-strängat RNA-virus består i princip på ett konstlat sätt tvingar en viral replikationscykeln i en producerande cell genom att transfektera cDNA som kodar för den minimala infektiösa molekylära maskineri, som kallas ribonukleoprotein eller RNP (Figur 2). De RNPs bestå av det virala polymeraset (P-och L-proteiner), varvid nukleoprotein (NP) och fullängds-antigenomiskt RNA av viruset. Denna RNA + antigenom är the-mall som krävs för att generera de komplementära RNA-genom, som, även i samband med resten av proteinerna i den virala RNP, rekapitulerar samma smitt komplex som en naturlig virus skulle släppa på cellens cytoplasma vid infektion (Figur 2A ). Från detta steg framåt, kan den virala cykeln vidare naturligt och rekombinanta virioner encapsidating de modifierade genomen, kommer att genereras (Figur 2B). Anmärkningsvärt, transfektion av den genomiska cDNA istället för den antigenomiska cDNA försämrar kraftigt eller upphäver räddnings effektivitet 2,28-30 helt. Även när antigenomiskt cDNA transfekteras, är effektiviteten av inkapsling av det rekombinanta RNA in RNP i transfekterade celler antagligen mycket låg. På grund av detta, räddnings protokoll för NDV innehåller ofta olika steg för amplifiering av de få virus-partiklar som frigörs från de ursprungligen transfekterade celler genom samodling av dem med permissiva celler och / eller av deninfektion i embryonerade ägg. Före räddnings kan cDNA manipuleras genom standardkloningsförfaranden i syfte att alstra de önskade modifieringar. Även om specifika mutationer av olika genprodukter och regulatoriska sekvenserna av virus kan rättframt uppnås på detta sätt, många av det publicerade arbete som involverar rekombinant NDV har krävt tillägg av en ny transkriptionsenhet in i NDV-genomet. Liksom andra medlemmar av paramyxovirus familjen, kodar NDV genomet åtta olika proteiner i sex transkriptionsenheter, som differentiellt uttrycks beroende på deras placering i förhållande till 3 &#39;änden på en minskande gradient avgörande för virusets livscykel 1. På grund av detta måste platsen för den nya transkriptionsenheten inom genomet väljas omsorgsfullt för att uppnå en balans mellan uttrycket av transgenen och nedskrivning av viral replikation. Insättning mellan P-och M-gener har använts mest, tHough andra platser har också testats 13,31. Oavsett insatsen, kloning i NDV cDNA måste följa vissa regler för att generera en rescuable konstruktion: (i) varje ny gen som ska ingå i NDV genomet måste vara under kontroll av lämpliga signaler för den virala RNA-beroende-RNA polymeras. Dessa sekvenser måste tillsättas uppströms om ny öppen läsram (ORF) så polymeraset kan känna igen slutet av föregående genen (GE) och början av den nya transgenen (GS), åtskilda av en enda nukleotid intergeniska sekvensen (IG) . Tillägg av en giltig Kozak (K) sekvens för att förbättra eukaryota ribosomala översättning rekommenderas också för bättre främmande proteinuttryck 32, (ii) effektiv replikering av NDV, som för de flesta medlemmar av Paramyxoviridae familjen är beroende av genomet längd är multipel av sex 33, varför någon insättning i NDV har att följa den här &quot;regeln om sex&quot;. Om nödvändigt required ytterligare nukleotider kan läggas nedströms den nya ORF, och (iii) bör kontrolleras sekvensen av transgenen för att hitta möjliga GE och GS som sekvenser som kan inverka räddnings effektivitet, transgen uttryck och / eller virus livskraft. Om det finns, måste dessa sekvenser avlägsnas genom tyst mutagenes. Alstring av rekombinant fullängds-cDNA efter ovannämnda reglerna är det första steget för att effektivt framställa en genetiskt modifierad NDV som beskrivs här. I det system som alla DNA-konstruktioner är under kontroll av T7-RNA-polymeras-promotorn (Figur 3). Detta cytoplasmiska polymeras tillhandahålles i träns genom saminfektion med en rekombinant modifierad vaccinia-Ankara-viruset (MVA-T7) 34. Fig. 3A visar pNDV-B1 plasmiden, vilken kodar för fullängds-antigenomiskt cDNA 5. Figur 3B visar pTM1 plasmider kodar NP, P-och L-ORF. Plasmider pCITE-GFP, som kodar, under T7-promotorn, grönt fluorescerande protein (GFP), och pCAGGS GFP-18, som kodar samma ORF under kyckling beta aktin-promotorn 35, används som kontroller. I detta protokoll visar vi det förfarande för att rädda rekombinant NDV från cDNA av den lentogena NDV-stammen Hitchner B1 5 (Figur 4).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

Newcastlesjukevirus (NDV), prototypen medlem av Avulavirus släkte av familjen Paramyxoviridae 1, är en icke-segmenterade, negativ-sense, single-stranded, omsluten RNA-virus (fig 1) med potentiella tillämpningar som en vektor för vaccination och behandling av mänskliga sjukdomar. Fördjupad undersökning av dessa ansökningar har bara blivit möjlig efter införandet av omvänd genetik att rädda rekombinanta virus från plasmider som kodar för sina kompletta genom som cDNA 2-5. Viral cDNA kan enkelt modifieras in vitro genom användning av standardklonings-förfaranden för att ändra genotypen av viruset och / eller att inkludera nya transkriptionsenheter. Räddning av sådana genetiskt modifierade virus utgör ett värdefullt verktyg för att förstå faktorer som påverkar multipla stadier av infektion, såväl som möjliggör utveckling och förbättring av vektorer för expression och tillförsel av antigenerför vaccinering och behandling. Här beskriver vi ett protokoll för att rädda rekombinanta NDVs.

Räddning av NDV är en väletablerad procedur, rutinmässigt i de laboratorier som har tillgång till den fullständiga cDNA av viruset. Emellertid gör den inneboende stokastiska naturen av förfarandet det svårt att uppnå 100% räddnings effektivitet. Övervaka de tidiga stegen i processen, speciellt transfektionseffektiviteten och infektionen med MVA-T7, hjälper att identifiera möjliga problem. Figur 5A visar standard transfektion och transfektion / infektionseffektivitetsvinster som är tillrä...

Watch this Scientific Journal Video about Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA at JoVE.com

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastlevirus (NDV) har studerats under de senaste åren för att utveckla nya vektorer för vaccinering och behandling, bland annat. Dessa studier har varit möjlig på grund av tekniker för att rädda rekombinant virus från cDNA, såsom de som vi beskriver här.

Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Uttryck av Functional rekombinant hemagglutinin och neuraminidas Proteiner från Novel H7N9 influensavirus Använda baculovirusexpressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalbar hög genomströmning Urval Från faguppvisade Syntetiska Antibody bibliotek

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Utvärdering av Zika Virus-specifika T-cell svar i Immunoprivileged organ av infekterade Ifnar1- / - möss

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...