Name: high throughput microinjections of sea urchin zygotes
Uploaded: 2014-01-21T21:00:00
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Ringraziamo Santiago Suarez per la lettura critica del manoscritto e Betty Cowgill per gli aiuti in fotografia. Ringraziamo anche i revisori anonimi per il loro feedback critico. Questo lavoro è supportato dalla University of Delaware Fondo di ricerca.

1. Preparazione del solfato di protamina (PS) Piatti patinata <ol><li> Preparare la soluzione 1% di solfato di protamina (PS) aggiungendo 0,5 g di PS a 50 ml di acqua deionizzata, acqua distillata (DDH 2 O) in una provetta conica da 50 ml. Agitare bene ad alta velocità su un agitatore panchina a temperatura ambiente per 1-2 ore per garantire la completa dissoluzione del PS. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per almeno 3 mesi (assicurarsi per dissolvere completamente simile a gel precipitato ...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Delivery+of+DNA+and+Morpholinos+into+Mouse+Preimplantation+Embryos+by+Electroporation.">Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation.</a> Plos One. 7, 13 (2012).</li><li>Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+signaling+pathways+in+zebrafish+development+by+microinjection.">Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection.</a> Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).</li><li>Kola, I., Sumarsono, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+in+vitro+transcribed+RNA+and+antisense+oligonucleotides+in+mouse+oocytes+and+early+embryos+to+study+the+gain-+and+loss-of-function+of+genes.">Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes.</a> Mol. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+and+proteomic+perspective+of+sea+urchin+calcium+signaling+and+egg+activation.">A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation.</a> Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).</li><li>Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+increases+the+polyphosphoinositide+content+of+sea+urchin+eggs.">Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs.</a> Nature. 310, 414-415 (1984).</li><li>Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+regulating+the+timing+of+cytokinesis+in+embryonic+cells.">Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells.</a> Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).</li><li>Morris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytoskeletal+and+motility+proteins+in+the+sea+urchin+genome+assembly.">Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly.</a> Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cell+Geometry+on+Division-Plane+Positioning.">Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning.</a> Cell. 144, 414-426 (2011).</li><li>Davidson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+regulatory+network+for+development.">A genomic regulatory network for development.</a> Science. 295, 1669-1678 (2002).</li><li>Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulatory+logic+for+specification+of+an+embryonic+cell+lineage.">Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+controlling+the+embryonic+specification+of+endoderm.">A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm.</a> Nature. 474, (2011).</li><li>Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cis-regulatory+genomics+for+systems+biology.">Functional cis-regulatory genomics for systems biology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).</li><li>Showman, R. M., Foerder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+fertilization+membrane+of+sea-urchin+embryos+employing+aminotriazole.">Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole.</a> Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).</li><li>Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+the+hatching+enzyme+gene+in+the+sea-urchin+embryo.">Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo.</a> Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).</li><li>Jaffe, L. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+oocytes,+eggs,+and+embryos.">Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos.</a> Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).</li></ol>

Microiniezione è una tecnica potente per somministrare vari trattamenti quali DNA, mRNA, proteine ​​ricombinanti, perdita di funzione e guadagno di funzione reagenti, coloranti e loro combinazioni in uova, embrioni e cellule di diversi organismi 1-7. Tuttavia, alcune considerazioni devono essere tenuti a mente quando si progetta un esperimento microiniezione. E &#39;estremamente importante considerare la solubilità del trattamento consegnato e il volume di iniezione. Se la s...

Consegna trattamento efficace e riproducibile è una delle principali sfide metodologiche per i ricercatori. Diversi metodi sono stati stabiliti per fornire transitoriamente soluzioni di trattamento nelle uova, embrioni e cellule. Questi metodi includono elettroporazione (basato su una generano transitori pori nella membrana mediante piccoli impulsi elettrici) 1,2, lipofezione (consegna attraverso la fusione di liposomi contenenti trattamento con la membrana) 1, microparticelle bombardamento 1 (DNA viene precipitato sulla micron particelle di dimensioni metallo che vengono poi utilizzati per penetrare le celle ad alta velocità) e trasduzione (virus viene utilizzato come veicolo di consegna di transgeni). Al momento, la microiniezione è l&#39;unico approccio che tiene il vantaggio di fornire qualsiasi soluzione con un&#39;efficienza del 100% con reagenti minimi. Inoltre, una singola soluzione iniettabile può essere composta da una miscela complessa di trattamenti. Questa tecnica è stata utilizzata per successoly microinject le uova e gli embrioni da numerose specie come ricci di mare, pesce zebra 3,4 5, mouse 6, rana 7, 8 e bovini, nonché singole cellule in coltura tissutale 9. Blastomeri singole iniezioni a stadi di sviluppo successivi sono stati condotti anche 10-12. Gli attuali metodi di microiniezioni sono basati sul metodo della pressione di iniezione che è stato inizialmente descritto da Hiramoto 10, tuttavia, sono stati fatti grandi progressi verso l&#39;ottimizzazione di questo processo. Eccellente tecniche di microiniezione sono state descritte altrove 11, e qui descrivere uno dei metodi specifici attualmente utilizzati per microinject riccio di mare (Strongylocentrotus purpuratus) le uova appena fecondate. Per oltre un secolo, ricci di mare sono stati un valido modello sperimentale 15,16. I ricci di mare sono evolutivamente strettamente legati alla cordati (compresi noi) e l&#39;analisi diloro genoma ha rivelato che contengono tutte le principali famiglie di geni come l&#39;umano 17. Essi producono un gran numero di sincrono sviluppare embrioni trasparenti che possono essere facilmente manipolati. Utilizzo di riccio di mare come organismo modello, la comunità riccio di mare ha contribuito alla nostra comprensione del processo di fecondazione 18-21, cellulari processi biologici 22-24, e le reti di regolazione genica (GRN) 25-28. Microiniezione in zigoti riccio di mare richiede diversi passaggi. In primo luogo, le uova devono essere immobilizzato prima iniezioni (descritto di seguito). Piatti microiniezione sono rivestiti con protamina solfato (PS), che crea una superficie caricata positivamente a cui le uova carica negativa possono aderire 3. Le uova sono dejellied mediante incubazione in acqua di mare acida (pH 5,15) per 10 minuti, seguito da due lavaggi in acqua di mare naturale o acqua di mare artificiale (pH 8,0). Le uova dejellied sono accuratamente remato in linea rettanel mezzo del piatto PS rivestite in presenza di 1 mM 3-aminotriazole (3-AT), necessaria per inibire l&#39;attività di ovoperoxidase che viene secreto dai granuli corticali dell&#39;uovo a seguito di fecondazione 29. Questa fase è importante per prevenire l&#39;indurimento della busta fecondazione e l&#39;inserimento dell&#39;ago microiniezione. In alternativa a 1 mM 3-AT, 10 mM acido paraminobenzoic (PABA) può essere utilizzato. La soluzione iniettabile viene caricato in un ago microiniezione punta utilizzando microloading pipetta specializzata e montato su un supporto attaccato al micromanipolatore e gruppo pressore (Figura 1). Ogni ago può essere utilizzato per microinject singoli zigoti in esperimenti multipli in giorni diversi. Microiniezione può essere eseguita per 10-15 minuti fino zigoti indurire. Gli zigoti vengono quindi lavati con acqua di mare e coltivate a 15 ° C. Quando gli embrioni raggiungono cova blastula fase, rilasciano cova enzima che digerisce i componenti del fertilization busta 30 e permettere loro di staccarsi naturalmente dal piatto di PS-rivestito. Se necessario, gli embrioni possono essere staccate delicatamente dal piatto con una pipetta bocca o pipetta Pasteur soffiando delicatamente l&#39;acqua di mare sulle embrioni. Il metodo descritto consente microiniezione efficiente ed affidabile di 100-400 uova fecondate giudicato su un singolo piatto, fornendo un metodo ad alta produttività per analisi a valle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:211px;">14673-043</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope Axiovert 40C</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:211px;">4109431007990000</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:211px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;">Load injection solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nylon filter mesh 80 &#956;m</td>
			<td style="width:200px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:211px;">03-80-37</td>
			<td style="width:167px;">Filter eggs to get rid of debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">02707432 or 02707430</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13 374 12</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:200px;">Intramedic</td>
			<td style="width:211px;">PE-160</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protamine sulfate</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:211px;">194729</td>
			<td style="width:167px;">Attach dejellied eggs to injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea urchins S. purpuratus</td>
			<td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td>
			<td style="width:211px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea water</td>
			<td style="width:200px;">any pet store</td>
			<td style="width:211px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">0875713A</td>
			<td style="width:167px;">Injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9124</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9212</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfer pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13-711-9AM</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical needle puller </td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">PC-10</td>
			<td>Pull injection needles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

Microiniezione in cellule ed embrioni è una tecnica comune utilizzata per studiare una vasta gamma di processi biologici. In questo metodo una piccola quantità di soluzione di trattamento viene caricato in un ago microiniezione che viene utilizzato per iniettare fisicamente cellule immobilizzate singole o embrioni. Nonostante la necessità di formazione iniziale per eseguire questa procedura per la consegna ad alta produttività, microiniezione offre la massima efficienza e la consegna riproducibile di una vasta gamma di soluzioni di trattamento (comprese le miscele complesse di campioni) nelle cellule, uova o embrioni. Applicazioni alle microiniezioni includono la consegna dei costrutti di DNA, mRNA, proteine ​​ricombinanti, guadagno di funzione, e la perdita di reagenti funzione. Fluoroforo o colorimetrica viene aggiunto alla soluzione iniettata per consentire la visualizzazione immediata della consegna efficiente e un attrezzo per la normalizzazione affidabili della quantità della soluzione erogata. Il metodo descritto consente microiniezione di 100-400 ricci di mare zygotes entro 10-15 minuti.

GFP e mCherry costrutti reporter erano trascritto in vitro e microiniezione nelle uova appena fecondate. Gli embrioni sono state incubate a 15 ° C per 24 ore (fino allo stadio di blastula) e ripreso con microscopio Zeiss Observer Z1. Iniezione di costrutti reporter non ha dato luogo a difetti di sviluppo (Figura 6). Per la quantificazione dei segnali fluorescenti, acquisizione di immagini è stata eseguita a basso ingrandimento (100X) per catturare massimo pixel fluorescenti (Figure 6D...

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High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microiniezione è una tecnica comune per fornire strutture di DNA, mRNA, oligonucleotidi antisenso morfolino o altri trattamenti in uova, embrioni e cellule di varie specie.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Un metodo per la microiniezione di<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigoti

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...