Name: establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

ويود المؤلف أن يشكر لي زانغ، وشيان زي لي، وآرون هينز، وكلايتون هول على المساعدة التحريرية في هذه المخطوطة. تم تطوير هذا المقايسة في البداية في مختبر جورج أوتول، كلية جيزيل للطب في دارتموث. ويدعم البحث في مختبر الدكتور ماه من المنح المقدمة من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا والتليف الكيسي كندا.

1. MBC-B
<ol><li>
زراعة بيو فيلم (مقتبس من أوتول9).
	<ol>
<li>تنمو ثقافة سلالة البرية من نوع الاهتمام وسلالة متحولة لمدة 16 ساعة في وسيلة غنية في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>تمييع الثقافات المشبعة بين عشية وضحاها 1:100 في وسط جديد لمقاايسات مقاومة المضادات الحيوية. وسيلة قياسية ل P. aeruginosa...

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

تعرف مقاومة المضادات الحيوية في الخلايا العوالق بأنها زيادة في الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للمضادات الحيوية بسبب التغير الدائم في الخلايا(مثل الطفرة). آليات المقاومة أو التسامح بيو فيلم محددة التي تم تحديدها حتى الآن هي نتيجة للتعبير عن الجينات نوع البرية داخل الأغشية الحيوية. وب?...

تم تطوير مقايسات مقاومة المضادات الحيوية في البداية لتقصي مقاومة الثقافات العوالق (السباحة الحرة) للبكتيريا. نظرا لأن العديد من العدوى البكتيرية تنطوي على الأغشية الحيوية (الخلايا المرفقة بالسطح) ، فقد كنا مهتمين بتطوير طريقة لتقصي مقاومة المضادات الحيوية الخاصة بالبيو فيلم. ومع ذلك ، فإن معظم المقايسات مقاومة المضادات الحيوية غير مناسبة لقياس مقاومة الأغشية الحيوية. على سبيل المثال، تحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) هو المعيار الذهبي لتحديد مقاومة المضادات الحيوية للثقافات البكتيرية العوالق 1. هذا المقايسة ينطوي على خلط ثقافة العوالق المخففة مع سلسلة من المضادات الحيوية المخففة.  تركيز المضادات الحيوية التي تمنع النمو المرئي للخلايا العوالق هو هيئة التصنيع العسكري. وبما أن هذا الفحص يعتمد على تثبيط النمو ، بحكم تعريفه ، فإنه لا يمكن أن يعمل مع ثقافات بيو فيلم ، الأمر الذي يتطلب فحص حساسية المضادات الحيوية للخلايا في بيو فيلم متضخمة مسبقا. بدلا من قياس تثبيط النمو، يحدد المقايسة MBC-B الموصوفة هنا تركيز المضادات الحيوية التي تقتل الخلايا الموجودة بالفعل في بيو فيلم. وهكذا، يهدف هذا الفحص إلى محاكاة العلاجات بالمضادات الحيوية لالتهابات بيو فيلم الراسخة، وتوفير رؤية أكثر ملاءمة لمقاومة المضادات الحيوية البكتيرية في الجسم الحي.
منذ biofilms عموما أكثر مقاومة للمضادات الحيوية من الثقافات العوالق 2-4 ، كان من الضروري وضع طريقة تربط مباشرة مقاومة المضادات الحيوية من بيو فيلم إلى أن من ثقافة العوالق. وبالتالي فإن الهدف الآخر من هذه الطريقة هو أن تكون قادرة على مقارنة مباشرة مستوى مقاومة المضادات الحيوية بين الخلايا العوالق والبيو فيلم. إن المقايسات MBC-P و MBC-B الموصوفة هنا تجعل هذا ممكنا لأن الخلايا يتم استزراعها في ظروف مماثلة. لقد استخدمنا هذه الطريقة لدراسة العديد من الجينات التي تعتبر مهمة لمقاومة المضادات الحيوية الخاصة بيو فيلم 5-8 .

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

يسمح هذا البروتوكول بإجراء مقارنة مباشرة بين مقاومة العوالق والبيو فيلم لسلالة بكتيرية يمكن أن تشكل بيو فيلم في المختبر. يتم تلقيح البكتيريا في آبار لوحة ميكروتتر 96 بئرا. في حالة المقايسة العوالق ، يتم إضافة التخفيفات التسلسلية للعامل المضاد للميكروبات المفضل إلى التعليق البكتيري. في الفحص الحيوي ، بمجرد تلقيحها ، يتم ترك البكتيريا لتشكيل بيو فيلم على مدى فترة زمنية محددة. تتم إزالة الخلايا غير المرفقة من الآبار ، ويتم تجديد الوسائط وإضافة التخفيفات التسلسلية للعامل المضاد للميكروبات المفضل. بعد التعرض لعامل مضادات الميكروبات ، يتم فحص الخلايا العوالق للنمو. بالنسبة للآساءة بيو فيلم، يتم تحديث وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة تفتقر إلى عامل مضاد للميكروبات وتترك خلايا بيو فيلم لاسترداد. يتم فحص صلاحية الخلية بيو فيلم بعد فترة الانتعاش. يتم تعريف MBC-P لعامل مضادات الميكروبات على أنه أقل تركيز للدواء يقتل الخلايا في الثقافة العوالق.  في المقابل ، يتم تحديد MBC-B لسلالة من خلال تعريض الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل لتركيزات متزايدة من عامل مضادات الميكروبات لمدة 24 ساعة. يعرف MBC-B بأنه أقل تركيز للعامل المضاد للميكروبات الذي يقتل الخلايا في الفيلم الحيوي.

تم إجراء مقايسات MBC-P و MBC-B ، مقارنة حساسية نوع PA14 البرية مع PA14 ∆ndvB. تم استخدام البراميسين كممضادات حيوية. وتقدم النتائج المقابلة للخطوة 1-4-4(الشكل 1)والخطوة 2-3-4(الشكل 2). تم تلقيح PA14 و ∆ndvB في المقايسات MBC-P و MBC-B في ثلاثة نسخ. بعد الانتهاء من الخطوات 1.0-1.4 من بروتوكول MBC-B...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

إنشاء الحد الأدنى من تركيز مبيد الجراثيم لعامل مضاد للميكروبات للخلايا العوالق (MBC-P) وخلايا بيو فيلم (MBC-B)

يسمح هذا البروتوكول بإجراء مقارنة مباشرة بين مقاومة العوالق والبيو فيلم لسلالة بكتيرية يمكن أن تشكل بيو فيلم في المختبر باستخدام لوحة ميكروتتر 96 بئرا. تتعرض بكتيريا العوالق أو الأغشية الحيوية لتخفيف متسلسل للعامل المضاد للميكروبات المفضل. يتم اختبار الجدوى من خلال النمو على لوحات أجار.

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

إنتاج وتوصيف القالفات البشرية من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...