Name: establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Forfatteren vil gerne takke Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz, og Clayton Hall for redaktionel hjælp med dette manuskript. Denne analyse blev oprindeligt udviklet i laboratoriet af George O'Toole, Geisel School of Medicine i Dartmouth. Forskning i Dr. Mah's lab er støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada og cystisk fibrose Canada.

1. MBC-B
<ol><li>
Dyrkning af en biofilm (tilpasset fra O'Toole9).
	<ol>
<li>Der dyrkes en kultur af den vilde stamme af interesse og mutantstamme i 16 timer i et rigt medium ved 37 °C.</li>
		<li>Fortynd den mættede natten kulturer 1:100 i frisk medium for antibiotikaresistens assays. Et standardmedium til P. aeruginosa er M63 minimalt medium suppleret med magnesiumsulfat og arginin (se tabel 1). Dette medium stimulerer dannelsen af en mere robus...

<ol>
	<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics.">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li><li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance.">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene,+ndvB,+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells.">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+Analyzing+Static+Biofilms.">Growing and Analyzing Static Biofilms.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li><li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.+Growing+and+analyzing+biofilms+in+fermenters.">Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters.</a> Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li></ol>

Antibiotikaresistens i planktoniske celler defineres som en stigning i den minimale hæmmende koncentration (MIC) af et antibiotikum på grund af en permanent ændring i cellerne(f.eks. en mutation). Mekanismerne for biofilmspecifik resistens eller tolerance, der er blevet identificeret til dato, er resultatet af ekspressionen af vilde typegener i biofilm. Den klassiske definition af resistens gælder således ikke for biofilm. Der er imidlertid blevet fremlagt et andet sæt definitioner: Resistensmekanismer for...

Antibiotikaresistens assays blev oprindeligt udviklet til at analysere resistens planktoniske (fri-svømning) kulturer af bakterier. Da mange bakterielle infektioner involverer biofilm (overflade-vedhæftede celler), var vi interesseret i at udvikle en metode til at analysere biofilm-specifikke antibiotikaresistens. Men de fleste antibiotikaresistens assays er dårligt egnet til måling af resistens af biofilm. For eksempel er bestemmelse af den minimale hæmmende koncentration (MIC) guldstandarden til bestemmelse af antibiotikaresistens af planktoniske bakteriekulturer 1. Denne analyse indebærer blanding af en fortyndet planktonisk kultur med en fortynding serie af antibiotika.  Koncentrationen af antibiotika, der hæmmer den synlige vækst af planktoniske celler er MIC. Da denne analyse er afhængig af hæmning af vækst, kan den pr. definition ikke fungere med biofilmkulturer, hvilket kræver undersøgelse af cellernes antibiotikafølsomhed i en forgroet biofilm. I stedet for at måle væksthæmmende, MBC-B assay beskrevet her bestemmer koncentrationen af antibiotika, der dræber celler, der allerede findes i en biofilm. Således har denne analyse til formål at efterligne antibiotikabehandlinger af etablerede biofilminfektioner og give et mere relevant billede af bakteriel antibiotikaresistens in vivo.
Da biofilm generelt er mere antibiotikaresistente end planktoniske kulturer 2-4 , var det nødvendigt at udtænke en metode, der direkte relaterer antibiotikaresistensen af en biofilm til en planktonisk kultur. Et andet mål med denne metode er således at være i stand til direkte at sammenligne niveauet af antibiotikaresistens mellem planktoniske og biofilmceller. De MBC-P og MBC-B assays, der er beskrevet her, gør dette muligt, fordi celler dyrkes under lignende forhold. Vi har brugt denne metode til at studere flere gener, der er vigtige for biofilmspecifik antibiotikaresistens 5-8 .

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			1x&#160;M63
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare as a 5x&#160;M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.&#160; Dilute 5x&#160;stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			KH2PO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P285-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			K2HPO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			P288-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			(NH4)2SO4
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5132
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Magnesium sulfate
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Fisher
			</td>
			<td style="width:160px;">
			M63-500
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 1 mM final concentration.&#160; Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tobramycin
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Prepare 50 mg/m&#160;stock. Aliquot and store at -20&#176;C.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Arginine
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:160px;">
			A5131
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Add to 0.4% final concentration.&#160; Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.&#160; This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			96-well microtiter plates
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Corning
			</td>
			<td style="width:160px;">
			3595
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Sterile, flat-bottom, low evaporation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Tranferpette (multichannel pipette)
			</td>
			<td style="width:160px;">
			BrandTech
			</td>
			<td style="width:160px;">
			2703610
			</td>
			<td style="width:160px;">
			8-channel, 20-200 &#956;l
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:160px;">
			Multiprong device
			</td>
			<td style="width:160px;">
			Dan-Kar
			</td>
			<td style="width:160px;">
			MC48
			</td>
			<td style="width:160px;">
			48 prongs fit into &#189; of a 96-well microtiter plate
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (mbc-p) and biofilm cells (mbc-b)

Denne protokol giver mulighed for en direkte sammenligning mellem planktonisk og biofilmresistens for en bakteriestamme, der kan danne en biofilm in vitro. Bakterier er podet ind i brøndene i en 96-godt mikrotiter plade. I tilfælde af planktonisk analyse tilsættes serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel til bakterieophængene. I biofilmanalysen, når de er podet, overlades bakterierne til at danne en biofilm over en bestemt periode. Ikke-vedhæftede celler fjernes fra brøndene, mediet genopfyldes, og der tilsættes serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel. Efter udsættelse for antimikrobielt middel analyseres planktoncellerne for vækst. For biofilmanalysen opdateres medierne med friske medier, der mangler antimikrobielt middel, og biofilmcellerne er overladt til at komme sig. Biofilmcelles levedygtighed analyseres efter genfindingsperioden. MBC-P for antimikrobielt middel er defineret som den laveste koncentration af stof, der dræber cellerne i planktonkulturen.  I modsætning hertil bestemmes MBC-B for en stamme ved at udsætte præformerede biofilm for stigende koncentrationer af antimikrobielt middel i 24 timer. MBC-B defineres som den laveste koncentration af antimikrobielt middel, der dræber cellerne i biofilmen.

MBC-P og MBC-B assays blev udført, sammenligne følsomhed PA14 vilde type med PA14 ∆ndvB. Tobramycin blev brugt som antibiotikum. Der præsenteres resultater svarende til trin 1.4.4 (figur 1) og trin 2.3.4 (figur 2). PA14 og ∆ndvB blev podet ind i MBC-P og MBC-B assays i tre eksemplarer. Efter at have fuldført trin 1.0-1.4 i MBC-B-protokollen og trin 2.0-2.3 i MBC-P-protokollen blev de levedygtige celler belagt på en LB agarplade. Koncentrationer af tobramycin (<...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B at JoVE.com

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

Etablering af minimal baktericidkoncentration af et antimikrobielt middel til planktoniske celler (MBC-P) og biofilmceller (MBC-B)

Denne protokol giver mulighed for en direkte sammenligning mellem planktonisk og biofilmresistens for en bakteriestamme, der kan danne en biofilm in vitro ved hjælp af en 96-brønds mikrotiterplade. Planktoniske eller biofilmbakterier udsættes for serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel. Levedygtigheden dæmpes af vækst på agarplader.

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Bestemmelse af biofilm Initiation på virusinficerede celler af bakterier og svampe

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Udvikling og validering af et Ultrasensitive enkelt molekyle Array Digital enzym-forbundet Immunosorbent Assay for menneskelige Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Produktion og karakterisering af humane makrofager fra pluripotente stamceller

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...